張婷

（長(zhǎng)春圣金諾生物制藥有限公司，吉林長(zhǎng)春 130000）

隨著科技的發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，生物醫(yī)藥行業(yè)也得到了快速發(fā)展，單克隆抗體產(chǎn)業(yè)作為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要組成部分，其中CHO細(xì)胞（中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Chinese hamster ovary cell）培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的生產(chǎn)是目前醫(yī)藥領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。單克隆抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝基本要求：首先，要能通過(guò)CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)出合格的單克隆抗體；其次，CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝要能穩(wěn)定表達(dá)出合格的單克隆抗體；最后，CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝要實(shí)現(xiàn)高效率和高經(jīng)濟(jì)效益的生產(chǎn)單克隆抗體。CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的基本工藝流程：第一步，在培養(yǎng)基、適宜培養(yǎng)參數(shù)的條件下培養(yǎng)CHO細(xì)胞；第二步，CHO細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束將收獲液進(jìn)行純化工序處理來(lái)得到原液；第三步，將得到的原液經(jīng)過(guò)各指標(biāo)的測(cè)定（如抗體蛋白結(jié)構(gòu)、宿主蛋白含量及糖型分布等）來(lái)確定其制得的抗體產(chǎn)品的安全性和有效性。其中，CHO細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中的雜質(zhì)直接影響著收獲液的純化工序的復(fù)雜和難易，同時(shí)對(duì)收獲液制得原液的效率也有大的影響。目前來(lái)說(shuō)，對(duì)于不同糖型的單克隆抗體在純化工序中是很難分離的，如果想使收獲液的純化工序簡(jiǎn)單，那么必須從CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程對(duì)雜質(zhì)的含量加以把控，從而使得收獲液的雜質(zhì)含量低、純化工序簡(jiǎn)便，進(jìn)而使得制得的原液指標(biāo)符合抗體產(chǎn)品的安全性。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)特別是大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)過(guò)程中，要對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)參數(shù)和培養(yǎng)工藝流程進(jìn)行研究和把控，以實(shí)現(xiàn)單克隆抗體表達(dá)量和抗體生成效率的提高，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生成抗體的安全性[1]。

1 CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的培養(yǎng)基

1.1 培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中的功能與作用

在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)工藝過(guò)程中，培養(yǎng)基是細(xì)胞繁殖和產(chǎn)物表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，由于細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中要消耗物質(zhì)和能量來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的生成，而培養(yǎng)基在其中發(fā)揮著提供物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的作用，是細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。與此同時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的選擇要充分考慮到培養(yǎng)細(xì)胞的特性及表達(dá)產(chǎn)品的要求，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的有效性和表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)效率的提高。此外，隨著社會(huì)科技的發(fā)展和環(huán)保安全理念的不斷深入，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基也趨向于化學(xué)成分確定、無(wú)蛋白無(wú)動(dòng)物來(lái)源等以提高細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的穩(wěn)定性和安全性。

1.2 CHO細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與應(yīng)用

根據(jù)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入時(shí)間和目的的不同，培養(yǎng)基通常情況下分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基主要是細(xì)胞培養(yǎng)的初期用于細(xì)胞的繁殖和生長(zhǎng)階段，而補(bǔ)料培養(yǎng)基可以用于細(xì)胞繁殖的早期和代謝產(chǎn)物的表達(dá)階段。在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)過(guò)程中，要根據(jù)細(xì)胞不同階段的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)需求和代謝表達(dá)來(lái)選擇適用的培養(yǎng)基種類。近年來(lái)，CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基已開發(fā)多種，有商品類和定制類可以滿足CHO細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和代謝表達(dá)需求[2]。相比于商品類的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基，定制類培養(yǎng)基可以根據(jù)具體CHO細(xì)胞株的特性進(jìn)行針對(duì)性的配制和優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量的提高，同時(shí)還有利于對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化處理。

1.3 CHO細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

在CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)工藝過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化是提高表達(dá)抗體產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量的重要工藝手段之一。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)化中，主要的優(yōu)化方式有3種。（1）選用多種商品類培養(yǎng)基進(jìn)行組合混料實(shí)驗(yàn)，根據(jù)CHO細(xì)胞培養(yǎng)的情況來(lái)選出較好的組合混料培養(yǎng)基。（2）選用固定的培養(yǎng)基并向其中添加微量元素、氨基酸、生物因子及維生素等物質(zhì)，通過(guò)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)影響最大的物質(zhì)，然后再有針對(duì)性地進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化處理。（3）根據(jù)CHO細(xì)胞的情況來(lái)分析CHO細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中和代謝表達(dá)過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和限制因子，然后進(jìn)行針對(duì)性的添加或去除，從而達(dá)到優(yōu)化培養(yǎng)基的目的[3]。此外，對(duì)于CHO細(xì)胞的優(yōu)化，先進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，然后進(jìn)行培養(yǎng)工藝的放大對(duì)優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，以確定最終的CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的培養(yǎng)基。

2 CHO細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)分析

在CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)工藝過(guò)程中，對(duì)培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度及環(huán)境的溶氧情況等參數(shù)都有一定的要求。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)參數(shù)的研究來(lái)確定CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體工藝的最佳培養(yǎng)參數(shù)。目前，在CHO細(xì)胞培養(yǎng)中變溫培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛，在CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖階段和代謝產(chǎn)物表達(dá)階段的溫度控制在不同的范圍內(nèi)，在繁殖的后期階段將溫度降低以延緩CHO細(xì)胞的死亡來(lái)提高代謝產(chǎn)物的表達(dá)量。與此同時(shí)，在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境酸堿度的把控也影響著CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和代謝的產(chǎn)物表達(dá)，對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧情況也是影響CHO細(xì)胞培養(yǎng)效率的重要指標(biāo)參數(shù)[4]?，F(xiàn)階段，CHO細(xì)胞培養(yǎng)多采用攪拌式的反應(yīng)器，在攪拌的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝對(duì)氧氣的需求，同時(shí)有效去除多余的二氧化碳（CO2）以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的有效進(jìn)行，然而過(guò)大的攪拌速率將會(huì)對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。因此，在CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程中，攪拌槳的速度要依據(jù)CHO細(xì)胞的耐受值而進(jìn)行合理的限定，同時(shí)渦旋的尺寸要大于細(xì)胞的最大直徑來(lái)避免細(xì)胞受到剪切傷害。因此，CHO細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)工藝設(shè)備的選擇都對(duì)CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體產(chǎn)生較大的影響。

3 CHO細(xì)胞放大工藝研究

在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)，培養(yǎng)工藝的放大是CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)的成本和穩(wěn)定性的考究，通常CHO細(xì)胞培養(yǎng)要先在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行工藝試驗(yàn)，然后到試驗(yàn)中試階段，最后至生產(chǎn)線大規(guī)模生產(chǎn)，即CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大的研究是非常必要的。（1）在CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化中，也要將優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)工藝的放大來(lái)驗(yàn)證和調(diào)整，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)參數(shù)的可實(shí)用性和高效性。（2）在CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝的放大過(guò)程中，可以更直觀、更清晰地分析出各個(gè)工藝環(huán)節(jié)和指標(biāo)參數(shù)對(duì)整個(gè)抗體產(chǎn)品生產(chǎn)效率的影響，從而實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體工藝生產(chǎn)的穩(wěn)定性[5]。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大的過(guò)程中，通常培養(yǎng)溫度、環(huán)境酸堿度等變化不大，而攪拌速度、通氣速率等因素受到試驗(yàn)規(guī)模大小的影響較大，要根據(jù)具體情況遵循一定的變化規(guī)則，來(lái)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)設(shè)備指標(biāo)參數(shù)，如渦旋設(shè)備的尺寸等等要做相應(yīng)的調(diào)整，從而實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體工藝的穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率的提高。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)藥已經(jīng)備受關(guān)注，單克隆抗體產(chǎn)業(yè)作為生物醫(yī)藥中的重要板塊，其CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體的工藝研究也越來(lái)越多。通過(guò)對(duì)其CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)參數(shù)分析及工藝的放大等研究分析來(lái)實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)而推動(dòng)單克隆抗體產(chǎn)業(yè)在醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷向前發(fā)展。