高麗麗 刁曉明 李云 翟旭亮 周春龍

（1. 西南大學動物科技學院 重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產業(yè)技術研究院，重慶 400715；2. 西南大學淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715；3. 重慶市水產技術推廣總站，重慶 400020）

脊椎動物性別決定是生物學研究的一個核心的領域。其性別決定機制的多樣性非常值得關注，特別是爬行動物。脊椎動物的性別決定方式有兩種類型，即基因決定型（Geneotypic sex determination，GSD）和環(huán)境決定型（Environmental sex determination，ESD）［1-4］。GSD 類型指子代的性別是通過受精決定，它不受外界環(huán)境的影響，胚胎發(fā)育成雌性或雄性取決于其性染色體的組成。XY型（或ZZ型）發(fā)育成雄性，XX型（或ZW）型將發(fā)育成雌性［4］。ESD類型指受精卵發(fā)育成雌性還是雄性依賴于環(huán)境對個體發(fā)育早期的影響（如溫度、濕度等）［5-6］，在這種類型中，以溫度依賴型性別決定（Temperature-dependent sex determination，TSD） 方式最為廣泛。

爬行動物的性別決定機制研究領域豐富廣泛。20世紀50年代以前，爬行動物是否有性染色體的分化，尚不清楚。直到1962年，Becak［7］第一次報道爬行類存在異型染色體后，后續(xù)的研究證實爬行動物存在GSD類型。爬行動物生命中的兩個重要事件：一是繁殖機制（卵生還是胎生）；二是性別決定方式（GSD還是ESD中的TSD）。以前研究者認為TSD機制和卵生有關系，和胎生不可能有關系［8］。最近這種觀點被推翻［9］。研究者發(fā)現雌性胎生蜥蜴在持續(xù)高溫的實驗條件下，后代全部是雄性。由于其在實驗室進行，自然條件下能否有同樣結果不得而知。這些研究結果表明爬行動物的胎生繁殖機制和性別決定方式的選擇與哺乳動物并不一樣，其機制有待深入研究。爬行動物中同一個目，同一個科甚至同一個屬的物種之間也會存在不同的性別決定方式。不論是胎生還是卵生的物種都可能出現GSD或者TSD機制，或者二者同時出現。

孟德爾遺傳分離定律解釋了后代1∶1的性別比例，只要不同性別適合度沒有差異，性別比例就趨于統一［10］。如哺乳動物GSD類型，但并不適用非哺乳動物，如蜥蜴類中的小染色體［11］，有鱗目中的多性別和同型染色體系統等［12］。所以盡管性染色體與GSD機制關系密切，但要闡明爬行動物GSD的具體機制，仍然是個難題。龜鱉類是爬行動物中十分特化的一個類群，最早出現在晚三疊紀，與恐龍同代，至今已有2.5億多年的歷史［13］，在漫長的地史演變歷程和地質變遷方面具有重要參考價值［14］。

中華鱉隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科（Trionychidae）、鱉屬（Trionyx），是一種名貴水產動物［15］。我國目前已成為世界最大的中華鱉養(yǎng)殖、消費和出口的國家。中華鱉養(yǎng)殖業(yè)是我國高效特種水產養(yǎng)殖業(yè)之一，近幾年，由于生態(tài)環(huán)境的破壞和人為獵捕，野生鱉自然資源迅速衰退，而市場需求量不減，開展中華鱉保護狀況研究已刻不容緩［16］。中華鱉生態(tài)養(yǎng)殖也是重慶打造百億生態(tài)漁產業(yè)鏈的重要特色養(yǎng)殖品種。雄鱉各方面的性狀優(yōu)良，單價相對高，比雌鱉更受市場歡迎，然而目前距離實際應用還很遙遠（子代雄性比例＜65%）［17］。為此，國內外學者開展了大量研究，并取得了豐富的研究成果［18-22］，但缺乏系統的報道。鑒于此，本文對爬行動物（中華鱉）性別決定方面的研究進行了綜述，并探討爬行動物性別主導因素之間的關系，以期為精準攻克中華鱉育種難題奠定理論基礎，助推中華鱉生態(tài)產業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

1 中華鱉生物學特征

我國分布的鱉屬動物有兩個種，即中華鱉和山瑞鱉（Palea steindachneri）。中華鱉最常見，俗稱甲魚、王八、團魚、神守等［9］。除西藏外分布于我國各個地域，國外分布于俄羅斯、日本、朝鮮、越南［23］。因地域氣候和養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的不同，在體色上略有差異。中華鱉用肺呼吸，是以肉食為主的雜食性動物，形態(tài)扁平，呈近圓形或橢圓形，背甲周邊有一圈從外向內，由薄到厚的結締組織（俗稱“裙邊”），裙邊寬厚程度是判斷中華鱉品質優(yōu)劣的一個重要指標。我國是世界上養(yǎng)鱉最早的國家，早在春秋時代范蠡的《養(yǎng)魚經》（公元前 460 年）中就有“內鱉則魚不復去”的記載［24］。目前中華鱉已被列在《國家保護的有益或者有重要經濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》。近年來的環(huán)境惡化和過度捕撈，野生中華鱉又被自然保護聯盟的紅色名錄中列為易危狀態(tài)。

中國首位諾貝爾自然科學獎得主屠呦呦在卡羅琳醫(yī)學院諾貝爾大廳作《青蒿素的發(fā)現中國傳統醫(yī)學對世界的禮物》的演講中提到 “中國醫(yī)藥學是一個偉大寶庫，應當努力發(fā)掘，加以提高”。中華鱉在中國傳統醫(yī)學具有重要影響力。屈原《楚辭-招魂》載“靦鱉炮羔，有拓漿此”，乃楚國宮廷之佳肴；根據《神農本草經》、《本草綱目》記載，鱉肉滋陰補腎、健脾健胃和清熱消淤等功效，可以治療陰虛陽亢、久病泄瀉、婦女閉經、虛弱盜汗等癥狀。中華鱉的血富含動物膠、碘和維生素D，外敷可除中風口渴、還可以補血、消腫、平肝火，治療肝脾腫大和肝硬化等癥。此外，鱉制品具有抗癌和降低類固醇等作用［25］。但目前還沒有全面挖掘其對人類的價值，研究成果大大滯后于它對社會的影響。

2 中華鱉性別決定機制的研究

2.1 中華鱉溫度依賴型性別決定機制研究

爬行動物作為變溫動物，和溫度之間的關系一直是ESD機制研究的熱點之一。自1966年首次報道TSD機制［26］。經過數十年的研究，研究者陸續(xù)發(fā)現爬行動物普遍存在TSD模式［27-29］。爬行動物TSD模式分為三種：MF型（低溫產雄性，高溫產雌性）；FM型（低溫產雌性，高溫產雄性）；FMF型（低溫和高溫均產雌性，中間溫度產雄性）［30］。2012年發(fā)現一種新的FMFM模式［31］。關于爬行類TSD模式結論存在分歧。Bull［32］證實斑瞼虎（Eublepharis macularius）的TSD機制屬于FM模式，但Viets等［33］發(fā)現，在雄性孵化溫度下，隨著溫度增加，雌性比例大幅度增加。這樣斑瞼虎的TSD模式就不再是FM型，而是FMF型。

屬于TSD機制的物種通常缺乏性染色體，胚胎性別的分化取決于卵孵化溫度［34］，且其影響具有時效性［35］。孵化溫度只有在溫度敏感期（Thermal sensitive period，TSP）對后代比例有顯著影響［8］。在TSP期間，使用芳香化酶（雄激素轉化為雌激素的關鍵因子）抑制劑或者雌二醇（Estadiol，E2）可以反轉性別［36-38］。研究已報道孵化溫度影響魚類、龜鱉類、蜥蜴、鱷魚等性別分化方向［8，10］。但是其作用機制比較模糊。最近報道高溫反轉性別時，物種體內基因伴隨著大量的甲基化修飾，認為環(huán)境可能和甲基化修飾有關［39］，但是有待深入探究。

爬行動物TSD機制的生理和生態(tài)調控機理已有相關報道［40-41］?？墒荰SD機制是爬行動物正常生命史的一部分，還是只發(fā)生在人工或實驗條件下，目前不清楚。有報道TSD機制適應壽命短的魚類［42］和蜥蜴［43］，性別比例輕微偏離 1∶1［44-45］。然而還沒有其適應長世代的龜鱉類的報道。因為1∶1的性別比例對長世代物種來說是最優(yōu)選擇，如果溫度決定性別，那么為了維持最優(yōu)性比，這些TSD物種是如何適應不斷變化的氣候和條件［46］，懷卵母體可以通過選擇巢址或者預測后代性狀來優(yōu)化后代性比［47-49］。但是，根據自然選擇論，這些個別選擇并不能夠保持穩(wěn)定，TSD種類很可能面臨生存威脅。

溫度影響下的性別漂變現象能否使TSD較GSD機制在爬行動物的現實生物界中更具有優(yōu)勢［4］，研究者對此提出了許多假說和模型，并在個別物種中取得了標志性的結論，可是這些結論是否具有普遍性無從得知?？梢哉J為當環(huán)境對一種性別更有利時，TSD比GSD機制有優(yōu)勢［50］。關于TSD和GSD機制的關系，有一些認為GSD機制是祖先類型，TSD機制是衍生方式［51］。有學者則認為TSD機制是原始方式，GSD機制是獨立進化的分支［52］，還有學者認為TSD機制實際上是異常的GSD機制，兩者之間可以發(fā)生轉換關系（TSD-GSD，或者GSD-TSD），并主要發(fā)生在魚類、壁虎、蜥蜴和龜類［53-54］。研究也表明TSD-GSD機制轉變在長世代種類更易發(fā)生，因為壽命越短越增加由TSD機制帶來的負面效應，如性別比例漂變［55］，然而目前GSD-TSD機制轉變在脊椎動物中還很少發(fā)生［56］。因為容易產生YY或WW型致死個體。近年來借助基因組測序技術進行甲基化修飾、轉錄組等研究發(fā)現龜類TSD-GSD-TSD機制轉換［54，57］，這種轉換伴隨著1-20倍高速率的染色體數目進化的細胞重組，并且得到研究者驗證［58-59］。這些研究結果意味著TSD和GSD模式的轉換途徑具有多種多樣的特點。

從目前研究結果來看，TSD機制在爬行動物中具有種類多樣的特點。不同物種的TSD模式、同一物種中不同TSD模式的內在調控機制以及TSD機制和GSD機制的關系都需要進一步的研究和探索。中華鱉作為爬行動物代表，中華鱉TSD機制研究仍然停留在宏觀層面，國內朱道玉［21］認為中華鱉屬于TSD機制，低溫產雌性，高溫產雄性；而聶劉旺等認為低溫產雄性、高溫產雌性［20］；Kawagoshi等［18］報道中華鱉存在微小型ZW/ZZ型性染色體，認為中華鱉性別決定方式屬于GSD機制。ESD類型理論上不存在異型性染色體。但是，國外學者發(fā)現溫度確實可以改變中華鱉后代性比，由于比例數量差距不大，所以并不能說明中華鱉屬于TSD類型。以上研究結果表明，由于實驗條件不同，其結果目前還不能參考，而TSD機制還可能涉及激素、酶活性及pH水平等，所以這些難題的解決需要我們更深入的研究工作。

2.2 中華鱉基因型性別決定機制（GSD）研究

爬行動物GSD機制的復雜程度介于魚類和哺乳類之間。有些只屬于GSD機制［60］；有些屬于GSD機制的后代性別比例也易受環(huán)境的影響［61］，例如豹子壁虎［62］和蜥蜴［63］。甚至自然條件下嚴格的GSD機制，在實驗條件下溫度也會發(fā)揮重要作用［64］。在這種情況下溫度不是自適應的，而是溫度的副作用在影響此分子過程［2］，如溫度通過影響酶的活性（芳香化酶）和性別決定基因的表達來操控該過程。此外，在緊密相關的類群中也會發(fā)現不同的性別決定機制［65］，甚至在同一物種不同的種群中［66］，性別決定機制的轉換也是高頻率的發(fā)生在同一個進化時間尺度上［67］。目前很多研究證實在親緣關系較近的爬行動物中同時具有GSD和TSD機制［63，68-70］，這說明TSD和GSD機制的界限是模糊的［71］。為了解釋TSD和GSD機制的相互作用，研究者假設：GSD+EE型，即理論上基因決定性別，但是在胚胎發(fā)育的過程中性別可以被溫度反轉；TSD型，即對環(huán)境敏感且可以發(fā)生遺傳的變化，可是在個體水平上性別是由環(huán)境決定的，所以仍然被歸為TSD型；TSD+GSD型，即性別由溫度或基因決定［4］。根據這些研究結果，我們推測兩種機制的進化過程可能是相似的，只是為了適應不同的環(huán)境，某一種機制會選擇加速進化。

性染色體在GSD機制中扮演重要角色，性染色上的基因決定物種性別［72］。目前在屬于GSD類型的20種龜類中已發(fā)現8種存在不同的性染色［11，73］。哺乳動物屬于典型的GSD類型，其雄性性別由SRY基因啟動［74］。只要其在胚胎期選擇好性別，個體的性別在整個生命中會保持穩(wěn)定。非哺乳動物普遍缺失SRY基因，研究報道除Sry外，哺乳動物中Sox9、Cyp19a1、Dmrt1、Dax1、SF-1、Mis、Foxl2和Amh等基因參與了爬行動物胚胎性別決定［57，75］。生殖嵴和后來雙向潛能性性腺發(fā)育涉及Sf1［76］和Wt1［75］基因。雄性性別決定和分化通路涉及Sox9［58，77］和Dmrt1［51］等基因。雌性性別決定基因的研究沒有雄性那樣清楚和快速。Foxl2［51］、Cyp19a1［51］和Rspo1［57］基因同時參與屬于GSD和TSD機制的脊椎動物的卵巢發(fā)育。這些物種的大腦中存在起始溫度敏感位點，溫度通過性腺本身調控溫度敏感基因的變化，最后通過神經傳導改變性別［78］。性別決定依賴這些關鍵基因，如果某一種被干擾，性別則可能被反轉。非哺乳動物個體的性別時常發(fā)生變動，例如在魚類和爬行動物中性別表型決定即使在成年階段也不是最終的。特別是物種變化的生活環(huán)境會加速其性腺和性別表型的改變。因此對于爬行動物而言，個體的遺傳表型和其所攜帶的性染色體沒有必然的關系［76］。

以上研究結果表明，GSD機制物種中性別相關基因會響應溫度的變化。哺乳動物和爬行動物性別基因具有保守性，但是爬行動物中的性別基因會被外界影響，不像哺乳動物體內具有恒溫機制，可以避免溫度對體內基因的影響。按照脊椎動物進化路線分析，TSD機制是低等脊椎動物中隨著進化需要不斷完善的性別決定機制，GSD機制是進化到高等階段采用的性別決定方式，同時存在的GSD和TSD機制是中間方式，無論TSD-GSD，還是GSD-TSD轉換也只發(fā)生在進化不完善的物種中，爬行動物中出現多種GSD類型可能是由于其物種豐富，生活環(huán)境不同，進化歷程不統一等造成的。即使在哺乳動物中，敲除關鍵基因，性腺表型也會發(fā)生在成年個體或胚胎的性腺發(fā)育過程中［79］。所以，即使在成年個體，脊椎動物的性腺結構和功能也需要很多因素來積極維持。綜上，基因在脊椎動物性別決定中占有重要作用。

爬行動物中參與GSD機制的相關基因與哺乳動物中Sry基因相比，作用是微弱的，可以被溫度輕易反轉。在基準溫度下，胚胎形態(tài)分化的第一個階段比在雌性或雄性孵化溫度下推遲，說明沒有溫度的作用，基因誘導性別過程時間會延長，要發(fā)育為雌性或雄性，必須達到一定閾值。對于TSD機制，并不是基因對性別沒有作用，沒有基因影響，性別比例不可能形成，所以溫度和基因關系很密切，共同決定性別。對于爬行動物，環(huán)境因素的影響要大于基因效應。

爬行動物普遍缺少性染色體，但是已經證實在中華鱉中存在微小型ZW/ZZ型染色體，所以中華鱉性別決定方式應屬于GSD機制。雖然目前對中華鱉性別調控機制有了一定程度的認識，但這種認識并不完整。動物性別決定發(fā)生在一個時間段并依賴幾個關鍵基因［76］。從現有研究來看，關于中華鱉GSD機制的研究比較空白，大部分集中在時空表達水平分析，主要有Cyp19a1［80］、Amh［81］、Sox9［82］、Dmrt1［82］和Foxl2［22］。這些關鍵基因在中華鱉組織中呈性別二態(tài)性表達，功能和其它脊椎動物中的功能有細微差異，進一步表明脊椎動物性別決定基因功能的保守性

3 結語

爬行動物的進化比較特殊，性染色體的進化處于過渡狀態(tài)，仍然保留低等動物性染色體的特征。爬行動物的性別決定受溫度和基因雙重調節(jié)，在極端溫度下，溫度甚至可以超越基因效應。其性別分化前后，相關基因的上調或下調是爬行動物性腺發(fā)育的原因還是結果，尚不清楚。外源性激素誘導部分胚胎及成年脊椎動物性腺分化的觀點已被普遍認同［83］，但性激素是影響正常性腺分化中某一成分的功能還是干擾正常生化反應的模式也不清楚。為什么在爬行動物中性別決定基因會感應溫度的變化；如果是因為其缺乏恒溫機制，那么在鳥類這樣恒溫動物中，為什么外源因素誘導性別改變的現象一樣存在。此外，在爬行動物中，GSD和TSD機制之間的轉換是連續(xù)的還是中斷的，具體過程是怎樣的？這些問題依然是謎?？傊?，爬行動物性別決定通路相關基因的功能、溫度主導因素的作用機理及性別決定機制的進化途徑仍存在許多未被研究清楚的問題。

從現有研究來看，一方面，如果爬行動物不能快速適應以避免性別漂變的負面影響，再加上內部遺傳因素的沖突影響，全球氣候變化將對其造成嚴重威脅［84］。理論上，它們可以通過機制轉換、改變熱敏性，或者調節(jié)自身生理和行為等方式的來削減負面影響。但生理或性別決定機制似乎不太可能，因為這些機制是經歷了長期的進化選擇后所保留的，具有較高的穩(wěn)定性和保守性［85］。而母體效應進化的速率也與氣候變化的速率不一定一致，即使它們可以通過自身機制削弱環(huán)境溫度對后代性別影響［37］。但是如果外界溫度超過胚胎孵化溫度的閾值，這些物種則無法調控溫度帶來的負面效應。另一方面，存在于水生環(huán)境中的許多化學物質具有雌性化效果，因為它們能夠通過模仿雌激素與雌激素受體結合的作用來破壞內分泌系統。綜上，TSD種類的生存形勢不容樂觀。而GSD種類因為有遺傳系統的保護，可以有幸避免。

本文對爬行動物性別決定中主導因素的最新研究進行闡述，不是去預測未來會發(fā)生什么，只想了解性別決定基因、激素和溫度的作用，為什么在自然界中會存在如此差異的性別決定機制，這些主導因素在此過程中是如何作用的？從而為其他脊椎動物性別決定的研究提供資料。爬行動物性別決定及性別分化具有很大的不穩(wěn)定性和可塑性，利用外源激素來培育單性苗種可能產生一定的安全隱患，而溫度確實可以影響以上過程的發(fā)生，所以通過控制溫度來培育經濟價值高的單性苗種，是一種簡便環(huán)保且實際可行的人工誘導性別分化方式。中華鱉作為爬行動物代表，其性別機制典型，國內研究較少，且野生中華鱉數量逐年遞減。所以，期望加強其性別決定和分化機制的研究，也呼吁大家保護野生資源。

目前，雖然對爬行動物性別決定和分化的具體作用機制還不十分清楚，但是隨著分子生物學、細胞學、遺傳學的不斷發(fā)展及測序技術和平臺的不斷完善，可以大大降低物種基因組測序的成本。這將在一定程度上助力爬行動物全基因組的挖掘，幫助研究者更深入地從分子水平闡釋爬行動物性別決定和分化機制，同時我們就可以不用依賴模式生物的研究去探討非模式生物的性別決定通路。所以，隨著分子生物技術的不斷發(fā)展以及研究范圍的不斷擴大和深入，越來越多的性別標志基因將會被發(fā)現，性別決定分子網絡也會越來越完善，爬行動物性別決定和分化機制的揭秘值得期待。