陳建仁 李馳 關(guān)惠恒

【摘要】 目的 探討超敏熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法核酸檢測(cè)與乙型肝炎（乙肝）兩對(duì)半聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用。方法 155例乙肝患者分別采集血清樣本， 利用化學(xué)發(fā)光法和基于磁珠法自動(dòng)化核酸提取的超敏熒光定量PCR法分別進(jìn)行乙肝兩對(duì)半和乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）檢測(cè)。結(jié)果 155例樣本中乙肝兩對(duì)半共檢出12種血清類型， 其中小三陽(yáng)占58.06%， 大三陽(yáng)占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽(yáng)性率為62.58%， 檢測(cè)下限低至10 IU/ml， 其中小三陽(yáng)陽(yáng)性率為66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三陽(yáng)陽(yáng)性率為90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三陽(yáng)和大三陽(yáng)組超敏熒光定量PCR陽(yáng)性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 基于磁珠法自動(dòng)化核酸提取的超敏熒光定量PCR法可準(zhǔn)確測(cè)定病毒載量， 檢測(cè)下限低至10 IU/ml， 與傳統(tǒng)乙肝兩對(duì)半聯(lián)用有助于乙肝的臨床診斷、用藥指導(dǎo)及療效監(jiān)測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；磁珠法；核酸提??；超敏；熒光定量；聚合酶鏈反應(yīng)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.09.049

乙肝病毒（hepatitis B virus， HBV）是一種嗜肝DNA病毒， 可引起急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎等， 部分患者可演變成肝硬化或肝癌。乙肝已成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題， 我國(guó)為乙肝高發(fā)區(qū)， 人群表面抗原攜帶率高達(dá)7.18%， 慢性乙肝患者約2000萬(wàn)[1]。乙肝流行形勢(shì)嚴(yán)峻， 及時(shí)并準(zhǔn)確檢測(cè)HBV對(duì)防控乙肝尤為重要。目前臨床多采用免疫學(xué)方法檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物， 包括乙肝表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）和乙肝核心抗體（HBcAb）， 即乙肝五項(xiàng)或乙肝兩對(duì)半， 可反映機(jī)體感染后的免疫狀態(tài)， 但不能直接反映病毒在體內(nèi)的復(fù)制狀況， 且對(duì)空窗期或者隱匿性乙肝患者易漏檢[2]。隨著分子診斷技術(shù)的進(jìn)步， HBV-DNA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生， HBV-DNA含量是HBV復(fù)制最直接、最可靠的檢測(cè)指標(biāo)， 在及時(shí)診斷、療效評(píng)價(jià)與預(yù)后判定方面發(fā)揮著重要作用[3]。本研究分別采用化學(xué)發(fā)光法和超敏熒光定量PCR法對(duì)155例乙肝患者的乙肝兩對(duì)半及HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)， 以期闡明二者聯(lián)用在乙肝防控中的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年7～9月陽(yáng)江市公共衛(wèi)生醫(yī)院就診的155例乙肝患者， 男112例， 女43例， 男女比例約為2.60∶1；年齡14～81 歲， 平均年齡42.17歲。

1. 2 試劑 乙肝五項(xiàng)檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（64 T/盒， 預(yù)封裝）及HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）（32 T/盒）均購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

1. 3 設(shè)備 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（MAGLUMI 2000 Plus）購(gòu)自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；磁珠法自動(dòng)核酸提取儀（NP968-C）購(gòu)自西安天隆科技有限公司；熒光定量PCR儀（LightCycler480）購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1. 4 方法 分別按照相應(yīng)要求各采集5 ml靜脈血， 于3 h 內(nèi)分離血清， 低溫保存待檢。

1. 4. 1 乙肝五項(xiàng)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)， 即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。具體操作按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行， 根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定陰陽(yáng)性。

1. 4. 2 HBV-DNA檢測(cè)

1. 4. 2. 1 磁珠法自動(dòng)化核酸提取 采用磁珠法自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)提取血清樣本的HBV-DNA， 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 將核酸產(chǎn)物低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4. 2. 2 超敏熒光定量PCR法檢測(cè) 利用超敏熒光定量PCR法定量檢測(cè)低溫保存的核酸產(chǎn)物， 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作， 根據(jù)定量結(jié)果判定陰陽(yáng)性。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

155例樣本中乙肝兩對(duì)半共檢出12種血清類型， 其中小三陽(yáng)占58.06%， 大三陽(yáng)占20.00%。155例樣本超敏熒光定量PCR總陽(yáng)性率為62.58%（97/155）， 檢測(cè)下限低至10 IU/ml， 其中小三陽(yáng)陽(yáng)性率為66.67%， HBV-DNA平均含量（6.17±0.91）lgIU/ml；大三陽(yáng)陽(yáng)性率為90.32%， HBV-DNA平均含量（6.98±1.02）lgIU/ml。小三陽(yáng)和大三陽(yáng)組超敏熒光定量PCR陽(yáng)性率及HBV-DNA平均含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

乙肝兩對(duì)半是臨床上常用檢測(cè)HBV的方法， 目前國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的這類方法有膠體金、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等。此類方法快速、簡(jiǎn)便、成本低， 但靈敏度低、特異性差。對(duì)低病毒載量的空窗期或者隱匿性乙肝患者容易漏檢， 且不能直接反映體內(nèi)病毒的復(fù)制狀況 [2]。近年熒光定量PCR、基因芯片和PCR反向點(diǎn)雜交等分子生物學(xué)方法不斷涌現(xiàn)， 其靈敏度高、特異性好， 很好地解決免疫學(xué)方法的缺陷， 降低漏檢率[3， 4]。其中， 熒光定量PCR法因其具有更高的靈敏度， 且可對(duì)病毒進(jìn)行精確定量、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)， 在臨床上應(yīng)用最為廣泛[5]。

HBV病毒載量能反映乙肝患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況和感染性的強(qiáng)弱， 為患者治療方案的選擇和療效評(píng)價(jià)、治療終點(diǎn)判斷、耐藥和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供客觀依據(jù)。傳統(tǒng)乙肝治療中， 常以HBV-DNA<2000 IU/ml作為應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)之一， 但終止治療后常會(huì)出現(xiàn)病毒反跳的狀況。研究表明主要是因?yàn)榈洼d量的HBV未被監(jiān)測(cè)到， 導(dǎo)致病毒持續(xù)在體內(nèi)復(fù)制。準(zhǔn)確而敏感地監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)HBV-DNA載量的動(dòng)態(tài)變化對(duì)治療方案的選擇和療效評(píng)價(jià)至關(guān)重要[6-8]。

經(jīng)CFDA網(wǎng)站查詢， 目前通過(guò)審批的大部分HBV-DNA檢測(cè)產(chǎn)品的前期核酸提取多采用手工煮沸法， 不能自動(dòng)化， 費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 據(jù)報(bào)道回收率低， 重復(fù)性差， 靈敏度僅為500～1000 IU/ml[6， 9-11]。本研究采用超敏熒光定量PCR檢測(cè)試劑， 前期核酸提取采用全自動(dòng)磁珠法核酸提取系統(tǒng)， 通過(guò)裂解病毒使DNA充分游離出來(lái)， 再利用表面特殊處理的磁珠吸附DNA， 而蛋白質(zhì)、多糖及脂類等雜質(zhì)留在溶液中， 在磁場(chǎng)作用下磁性顆粒與液體分開(kāi)， 再經(jīng)洗脫得到病毒DNA。磁珠法核酸提取大大提高核酸的純度和得率， 由于采用自動(dòng)化提取， 重復(fù)性也更好， 交叉污染率更低， 后期熒光PCR的靈敏度高達(dá)10 IU/ml， 可以更好地指導(dǎo)臨床診斷、用藥及預(yù)后[10]。

乙肝兩對(duì)半主要反映機(jī)體對(duì)HBV的免疫狀態(tài)， 可間接反映HBV的傳染性及病情嚴(yán)重程度。臨床研究表明， 大三陽(yáng)患者傳染性很強(qiáng)[8]， 超敏熒光定量PCR結(jié)果也印證這一點(diǎn)。本研究中大三陽(yáng)患者熒光PCR陽(yáng)性率及平均病毒載量均為各組最高， 分別為90.32%和（6.98±1.02）lgIU/ml與小三陽(yáng)比較， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與王華、譚斌等[12， 13]研究一致。既往臨床認(rèn)為小三陽(yáng)患者傳染性較弱， 此次研究表明小三陽(yáng)HBV-DNA含量高達(dá)（6.17±0.91）lgIU/ml僅次于大三陽(yáng)， 與譚斌等[13]的研究一致， 小三陽(yáng)病毒載量已超過(guò)臨床抗病毒的應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)2000 IU/ml， 具有較強(qiáng)的傳染性， 應(yīng)及時(shí)治療[14]。（HBsAg+HBsAb+）， （HBsAg+HBcAb+）， （HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb+）及（HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb+）四種血清型患者的HBV-DNA也為陽(yáng)性， 有一定的傳染性， 應(yīng)該引起重視， 國(guó)內(nèi)王華、張慶安等[12， 15]研究也對(duì)此做相應(yīng)報(bào)道。在本研究中， 部分血清學(xué)陽(yáng)性的患者超敏熒光定量PCR檢測(cè)卻顯示為陰性， 分析原因可能如下：①部分患者用藥治療后， HBV-DNA先于血清標(biāo)志物消失；②HBV整合進(jìn)宿主肝細(xì)胞， 導(dǎo)致血清中無(wú)法檢測(cè)到游離HBV-DNA[8]。

綜上所述， 基于磁珠法自動(dòng)化核酸提取的超敏熒光定量PCR法較傳統(tǒng)核酸檢測(cè)方法， 靈敏度更高， 前期樣本處理還可全自動(dòng)化。傳統(tǒng)免疫學(xué)方法又可直接反映機(jī)體對(duì)HBV的免疫狀態(tài)， 且成本和實(shí)驗(yàn)室條件要求都低。超敏熒光定量PCR法和免疫學(xué)方法聯(lián)合使用可在HBV的及時(shí)診斷、用藥選擇、療效評(píng)估及病程預(yù)測(cè)等方面發(fā)揮巨大的臨床價(jià)值。

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[收稿日期：2018-01-22]