史利雪　張圣平　苗　晗　薄凱亮　謝　慶　王　燁　顧興芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是我國重要的保護地栽培蔬菜之一。近年來，病毒病已成為影響黃瓜生產(chǎn)的重要病害，黃瓜受到病毒侵染后，早期心葉出現(xiàn)明脈，逐漸引起花葉和重花葉，嚴重時葉片皺縮畸形，有的果實呈螺旋狀扭曲，果面凹凸不平，果肉僵硬且苦澀，產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重降低（周健，2012；田桂麗，2015）。

關(guān)于侵染葫蘆科作物病毒病的各種病毒種類，Lovisolo（1980）首次報道了侵染葫蘆科作物的病毒有25種。國際病毒分類委員會（ICTV）在第七次分類報告中指出，經(jīng)確認的能侵染葫蘆科作物的病毒有38個確定種、9個暫定種和1個類病毒確定種（古勤生 等，2002）。顧興芳等（2005）報道了從瓜類作物上分離和鑒定的病毒有28種，侵染黃瓜的主要有7種。Romay等（2014）的研究表明，在自然條件下侵染葫蘆科作物的病毒至少有59種。

目前，在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)侵染黃瓜的病毒主要有：西瓜花葉病毒（WMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）、南瓜花葉病毒（SqMV）和瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）等（古勤生 等，2003；陳紅運 等，2006；青玲 等，2010；Gu et al.，2011）。李淑菊等（2003）利用RT-PCR技術(shù)對天津98份黃瓜病毒病樣本進行病毒種類檢測，結(jié)果表明，天津地區(qū)黃瓜主要毒原種類有CMV、WMV、煙草花葉病毒（TMV）3種，且CMV檢出率最高，存在病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象。文朝慧和南志標（2013）對甘肅省河西地區(qū)瓜類作物病毒病進行鑒定，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)瓜類病毒病主要病原為WMV、CMV、ZYMV和PRSV，自然條件下常發(fā)生復(fù)合侵染。熊艷等（2017）采用RT-PCR法對采自重慶地區(qū)的黃瓜病毒病樣品進行病毒種類檢測，檢測到CMV、WMV、ZYMV、SqMV和蕪菁花葉病毒（TuMV）5種病毒，且為4種病毒以上的復(fù)合侵染。

到目前為止，關(guān)于黃瓜主要病毒種類的檢測仍然不夠系統(tǒng)，這給生產(chǎn)上防治黃瓜病毒病帶來困難。本試驗在北京順義和昌平、山東壽光及廣東深圳地區(qū)采集了284份黃瓜病毒病樣本，并采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對病毒樣本進行鑒定，從而確定這些地區(qū)黃瓜病毒病的發(fā)病情況和毒原種類，為病毒病的防治和抗病育種工作提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

本試驗于2017年分別在北京順義和昌平地區(qū)、山東壽光、廣東深圳等黃瓜生產(chǎn)田，采集具有病毒病癥狀的黃瓜幼嫩葉片和果實作為樣品，將采集后的樣品放入冰盒中，帶回實驗室放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　病毒病的ELISA檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對黃瓜葉片的病毒種類進行檢測。購買了5種常見黃瓜病毒病ELISA試劑盒，分別為WMV、CMV、ZYMV、PRSV、CGMMV。具體操作步驟如下：

① 包被抗體：取包被抗體加入包被緩沖液（Coat Buffer），混合，吸取100 μL?孔-1抗體溶液于微孔板，酶標板于濕潤盒中室溫培養(yǎng)4 h，或冰箱中4 ℃過夜進行孵育，洗板。

② 加待測樣品：按照1∶10的比例在待測樣品中加入提取緩沖液（GEB），研磨后收集到離心管，3 000 r?min-1離心5 min，取上清液，吸取100 μL?孔-1加于酶標板中。室溫培養(yǎng)2 h，或4℃過夜進行孵育，洗板。

③ 加酶標抗體：分加酶標抗體溶液，吸取100 μL?孔-1溶液于酶標板中。室溫培養(yǎng)2 h進行孵育，洗板。

④ 加酶反應(yīng)底物顯色：其PNP底物，用PNP緩沖液溶解，吸取100 μL?孔-1底物溶液于酶標板中。在濕潤盒中培養(yǎng)60 min。

⑤ 檢測：采用酶標儀測定法，使用分光光度計，分別測定其在405 nm下的OD值，樣品OD值/陰性對照OD值≥2.0，則該樣品判斷為陽性，反之，則為陰性。

1.3　數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用單方面分類的方差分析法對北京順義和昌平地區(qū)檢測到的病毒進行差異顯著性分析，所用軟件為SAS 9.2分析軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃瓜病毒病的發(fā)病情況

本試驗共采集到黃瓜感病樣品284份，其中順義126份、昌平124份、壽光28份、深圳6份。感病材料癥狀主要表現(xiàn)為葉片重花葉，皺縮畸形，果實表面斑駁畸形（圖1），發(fā)病后期整體植株矮化，結(jié)果率低。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在順義地區(qū)采集的126份感病黃瓜材料葉片均有感病癥狀，其中38份材料的果實有病癥；在昌平地區(qū)采集的124份感病樣品的葉片都有感病癥狀，有33份材料的果實有病癥。在壽光地區(qū)采集的28份黃瓜材料中，葉片均有感病癥狀，果實無病癥。深圳地區(qū)感病材料大部分為水果型黃瓜，且葉片有癥狀，果實無病癥。

圖1　黃瓜病毒病田間癥狀

2.2　黃瓜病毒種類的差異與比較

對北京順義和昌平、山東壽光及廣東深圳采集到的284份黃瓜感病材料進行ELISA檢測，結(jié)果表明，在北京順義和昌平地區(qū)的感病葉片上均檢測出CMV、WMV、ZYMV 3種，在感病的黃瓜果實上只檢測出CMV病毒。在順義地區(qū)，CMV的檢出率最高，為100.00%，WMV、ZYMV的檢出率分別為51.59%、80.95%。在昌平地區(qū)，CMV的檢出率同樣最高，為100.00%，WMV、ZYMV的檢出率分別為53.23%、66.94%。北京順義和昌平地區(qū)黃瓜病毒病的病毒種類沒有差異，均為CMV、WMV、ZYMV，這2個地區(qū)CMV、WMV的檢出率差異不大，但ZYMV的檢出率具有顯著差異（表1）。

在山東壽光采集的感病葉片上檢測到CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4種 病 毒， 且CMV的 檢出 率 最 高， 為 100.00%，WMV、ZYMV、PRSV的檢出率分別為35.71%、35.71%、17.86%。在深圳地區(qū)采集的6份黃瓜感病材料中，檢測到CMV、WMV、PRSV 3種病毒，其檢出率分別為100.00%、50.00%、50.00%（表1）。

2.3　黃瓜病毒復(fù)合侵染分析

ELISA檢測結(jié)果顯示，順義和昌平地區(qū)分別有122份（96.83%）和104份（83.87%）材料檢測到2種或2種以上的病毒，說明北京地區(qū)黃瓜病毒種類比較豐富，復(fù)合侵染率很高。在黃瓜病毒復(fù)合侵染中，CMV和ZYMV的復(fù)合檢出率最高，在順義和昌平分別為45.24%和30.65%；另外，CMV和WMV的復(fù)合檢出率分別為15.87%和16.93%，WMV和ZYMV的復(fù)合檢出率分別為0和1.61%。CMV、WMV、ZYMV 3種病毒的復(fù)合侵染率分別為35.71%和34.68%（表2）。

壽光地區(qū)有17份（60.71%）材料檢測到2種或2種以上的病毒，其中CMV和WMV的復(fù)合檢出率為25.00%，CMV和ZYMV的復(fù)合檢出率為17.85%，CMV、ZYMV、PRSV 3種病毒的復(fù)合檢出率為7.14%，CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4種病毒的復(fù)合侵染率為10.71%（表2）。

深圳地區(qū)有3份（50%）材料檢測到2種或2種以上的病毒，其中CMV、WMV的復(fù)合檢出率為16.67%，CMV、WMV、PRSV 3種病毒的復(fù)合侵染率為33.33%（表2）。

表1　我國不同地區(qū)黃瓜病毒病發(fā)病情況

表2　黃瓜病毒病復(fù)合侵染類型和檢出率

3　結(jié)論與討論

近年來，病毒病嚴重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。本試驗對北京露地、壽光溫室、深圳大棚的黃瓜病毒病發(fā)病情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)病毒病對黃瓜露地栽培品種的危害最為嚴重，這可能與病毒病主要依靠蚜蟲、粉虱等刺吸式口器昆蟲傳播有關(guān)（秦小慶等，2017）。由于不同病毒侵染黃瓜表現(xiàn)出的病癥極其相似，無法根據(jù)病癥判斷病毒種類（David &Mizuki，1987），因此本試驗利用ELISA檢測法對北京、壽光及深圳地區(qū)黃瓜病毒病進行病毒種類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這3個地區(qū)均檢測出CMV且檢出率最高，在北京感病黃瓜果實上也檢測出CMV，說明CMV是北京、壽光及深圳的黃瓜優(yōu)勢病毒。

李淑菊等（2003）對天津黃瓜病毒病進行病毒種類鑒定，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)黃瓜主要毒原種類有CMV、WMV、TMV 3種病毒，且存在病毒復(fù)合侵染。熊艷等（2017）對重慶地區(qū)黃瓜病毒病進行病毒種類檢測，檢測到CMV、WMV、ZYMV、SqMV和TuMV 5種病毒，同樣存在復(fù)合侵染。以上研究結(jié)果與本試驗黃瓜病毒病發(fā)病情況和病毒種類具有一定的相似性。并且我國大部分地區(qū)存在黃瓜田間病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象（熊艷 等，2014；Hameed et al.，2014；Abrahamian et al.，2015）。

本試驗在不同地區(qū)的黃瓜上檢測出不同的病毒種類，可能是病毒的毒源分布具有地區(qū)性的原因。ZYMV的檢出率在北京順義和昌平地區(qū)存在一定的差異，這可能與當?shù)氐沫h(huán)境、氣候條件、昆蟲的種類有關(guān)。黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）是嚴重威脅葫蘆科作物生產(chǎn)的重要種傳病毒，是我國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物和進境檢疫性有害生物，本試驗在北京、山東及廣東地區(qū)并未檢測到該病毒。本試驗只采用了5種常見黃瓜病毒抗體對我國北京、山東及廣東地區(qū)黃瓜病毒病進行檢測，還需進一步鑒定是否存在其他病毒。

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