張鉉哲　韓曉旭　郭衍錦　李　璐　李媛媛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

中國是馬鈴薯生產(chǎn)大國，馬鈴薯已成為繼小麥、玉米之后的第三大作物，種植面積和產(chǎn)量居于世界首位（王立 等，2013）。黑龍江省因得天獨厚的冷涼氣候和地理條件，成為我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一（關(guān)紅穎，2011）。然而，近幾年由于黑龍江省降雨量大等天氣原因，馬鈴薯晚疫病發(fā)生十分嚴(yán)重。

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉Phytophthora infestans引起的馬鈴薯毀滅性病害，可造成巨大的經(jīng)濟損失（金光輝 等，2017）。馬鈴薯晚疫病菌通過不同交配型菌株之間異宗配合進行有性生殖，有性生殖可產(chǎn)生卵孢子，卵孢子可在土壤中越冬，成為翌年的初侵染源。不同交配型同時存在時說明馬鈴薯晚疫病菌適應(yīng)性和變異性增強（閔凡祥 等，2010）。Gallegly和Galindo（1958）在墨西哥中部首先發(fā)現(xiàn)了A1和A2交配型。張志銘等（1996）首次在國內(nèi)報道了A2交配型菌株。朱杰華（2004）首次在黑龍江采集分離的菌株中鑒定出A2交配型，其出現(xiàn)頻率僅為2.2%。王騰等（2016）對2011～2013年在黑龍江采集的菌株進行交配型測定，A1交配型占菌株總數(shù)的51.63%，其余為A2交配型。這些研究表明晚疫病菌由于不同交配型的出現(xiàn)，可以在田間進行有性生殖和無性繁殖，導(dǎo)致晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)變化對晚疫病害的防治提出了新的挑戰(zhàn)，因此研究馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化具有重要意義。

線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、無組織特異性等優(yōu)點，采用檢測線粒體多態(tài)性方法研究晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化效果更佳（May & Ristino，2004）。對馬鈴薯晚疫病菌線粒體DNA（mtDNA）多態(tài)性進行研究，逐步成為國內(nèi)外研究熱點。Griffith和Shaw（1998）采用改進PCR-RFLP方法將線粒體單倍型分為Ⅰa、Ⅱa、Ⅰb、Ⅱb。Rojas和Kirk（2016）研究表明，2008～2010年在密歇根州采集分離的124株致病疫霉的mtDNA單倍型均為Ⅰa型。Tian等（2016）鑒定了中國西北地區(qū)采集分離的馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型，結(jié)果檢測到Ⅰa、Ⅱa和Ⅱb 3種單倍型，其中Ⅰa為優(yōu)勢基因型。徐生軍（2010）利用PCR-RFLP方法，對黑龍江省采集分離的馬鈴薯晚疫病菌進行mtDNA單倍型檢測，共檢測到Ⅰa和Ⅱa兩種單倍型?？梢?，4種單倍型在不同國家和地區(qū)的分布具有一定差異。

SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、發(fā)生頻率高、批量操作等優(yōu)點（李建武，2011），近些年成為研究馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性的主要方法。對采自黑龍江的致病疫霉進行SSR基因型分析，吳艷清等（2012）鑒定出8種基因型，F(xiàn)-01型所占比例最高。而王晨（2013）的鑒定結(jié)果表明，從黑龍江采集的菌株共鑒定出6種SSR基因型，F(xiàn)-01為優(yōu)勢基因型。這些研究表明，黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的SSR基因型呈現(xiàn)一種動態(tài)變化。

Runno-Paurson等（2016）對愛沙尼亞的馬鈴薯晚疫病菌進行交配型和SSR基因型測定，結(jié)果表明該地區(qū)出現(xiàn)不同交配型菌株，SSR基因型也趨于多樣化。Rekad等（2017）通過SSR標(biāo)記分析、交配型和瑞毒霉敏感性的測定，對阿爾及利亞西北部地區(qū)的致病疫霉進行系統(tǒng)分析，結(jié)果表明不同交配型的菌株其對應(yīng)的優(yōu)勢SSR基因型有差異。Guo等（2010）通過交配型、同工酶基因型、mtDNA單倍型和RG57指紋的分析，發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌基因型和表現(xiàn)型與其他國家有差異。

我國缺少對馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型的研究。本試驗首先測定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的交配型；其次，利用PCR-RFLP方法和SSR標(biāo)記測定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的mtDNA單倍型和SSR基因型；第三，利用mtDNA單倍型和SSR基因型確定黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌的muti-locus基因型；最終，分析交配型與muti-locus基因型的相互關(guān)系。以期為馬鈴薯晚疫病菌的群體遺傳研究和馬鈴薯晚疫病的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試菌株及培養(yǎng)基

2015～2017年，在黑龍江省齊齊哈爾市、綏化市、哈爾濱市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集具有馬鈴薯晚疫病主要癥狀的單病斑葉片，將馬鈴薯切成約0.5 cm的薯片，用70%酒精將切后的薯片消毒，將病葉放入滅菌后的選擇性培養(yǎng)基中，把消毒處理后的薯片放在病葉上，加入一定的蒸餾水，用封口膜封蓋，19 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d。

供試培養(yǎng)基為20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基（張鉉哲和徐生軍，2010）。

1.2　馬鈴薯晚疫病菌的交配型測定

交配型的測定采用對峙培養(yǎng)法，使用20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基。將標(biāo)準(zhǔn)菌株A1（DN-3085日本）、A2（TBC-3韓國）與待測菌株預(yù)培養(yǎng)，然后將標(biāo)準(zhǔn)菌株和待測菌株菌餅分別與A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙培養(yǎng)，菌餅之間距離為3 cm。封蓋，每個菌株重復(fù)測定3次，19 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，在顯微鏡下觀察菌落交界處是否產(chǎn)生卵孢子。若待測菌株與A2標(biāo)準(zhǔn)菌株之間產(chǎn)生卵孢子，且與A1標(biāo)準(zhǔn)菌株間不產(chǎn)生卵孢子，說明所測菌株是A1交配型；相反，則是A2交配型。若與2個標(biāo)準(zhǔn)菌株間都產(chǎn)生卵孢子，且自身也可產(chǎn)生卵孢子，則待測菌株類型為自育型。

1.3　DNA提取

將待測菌株接種到20%番茄汁瓊脂培養(yǎng)基中，每株菌株接種3皿，19 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d左右，用滅過菌的濾紙吸干菌絲上的水分，裝入1.5 mL EP管中，-20 ℃下保存用于DNA的提取。參考Goodwin等（1992）的方法提取基因組DNA。

1.4　馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型測定

1.4.1引物序列與擴增體系線粒體DNA單倍型分析的PCR-RFLP方法參考Griffith和Shaw（1998） 的 方 法。 引 物 序 列：P2：F2：5′- TTCCCTTTGTCCTCTACCCAT-3′，R2：5′-TTACGGCGGTTTAGCACATACA-3′；P4：F4：5′-TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT-3′，R4：5′-CCGATACCGATACCAGCACCAA-3′。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增體系和程序參考Zhang等（2006）的方法。

1.4.2酶切體系目的片段回收采用核酸回收試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕。P2引物擴增片段使用MspⅠ酶切，P4引物擴增片段使用EcoR Ⅰ酶切，酶切體系為50 μL：膠回收產(chǎn)物10 μL，Buffer 5 μL，Enzyme 1 μL，ddH2O 補足至 50 μL。反應(yīng)條件為37 ℃水浴3 h。將酶切產(chǎn)物與溴酚藍(lán)混合，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像儀拍照。

1.5　馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型測定

1.5.1SSR引物序列與擴增體系馬鈴薯晚疫病SSR基因型劃分標(biāo)準(zhǔn)參考Knapova和 Gisi（2002） 的 方 法。 引 物 序 列 Pi4B：F：5′-AAAATAAAGCCTTTGGTTA-3′，R：5′-GCAAGCGAGGTTTGTAGATT-3′；Pi4G：F：5′-CGCTGTGTGGATGACAAGTA-3′，R：5′-TCGACCTGACATACGAGCTA-3′。SSR 擴 增 體系和擴增程序參考王晨（2013）的方法。

1.5.2聚丙烯凝膠電泳檢測將擴增后的樣品與同體積的Loading Buffer混合，95 ℃變性10 min，擴增產(chǎn)物用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照（Gene Company Limited GBOX-CHEMI-XRQ）。

2　結(jié)果與分析

2.1　馬鈴薯晚疫病菌分離

2015～2017年在黑龍江省哈爾濱市、綏化市和齊齊哈爾市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)共采集分離了126株馬鈴薯晚疫病菌菌株（表1）。

表1　黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌菌株信息

2.2　馬鈴薯晚疫病菌交配型分析

在黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病菌菌株中共發(fā)現(xiàn)了3種交配型。A1、A2和自育型菌株分別占所分離菌株總數(shù)的88.1%、6.3%和5.6%。從采集年份分析結(jié)果顯示，2015年采集的22株菌株中，共鑒定出A1和A2 2種交配型，其中，21株菌株為A1交配型（95.5%），僅1株菌株為A2交配型（4.5%）。2016年采集的32株菌株中共鑒定出3種交配型，其中26株A1交配型菌株（81.3%），4株A2交配型（12.5%），2株自育型（6.2%）。2017年共分離鑒定了72株菌株，3株菌株為A2交配型（4.2%），5株菌株為自育型（6.9%），其余64株菌株為A1交配型（88.9%），由此可見，自育型菌株比例逐年增長，各年份之間A1交配型所占比例具有差異。

從采集地區(qū)分析結(jié)果顯示，哈爾濱市采集分離的菌株均為A1型（100%），綏化市采集分離的菌株共鑒定出3種交配型，56株為A1交配型菌株（88.9%），5株為A2交配型菌株（7.9%），2株為自育型菌株（3.2%）。齊齊哈爾市采集分離的菌株共測定出A1、A2和自育型3種，分別為46株（86.8%）、2株（3.8%）和5株（9.4%）。以上結(jié)果顯示，哈爾濱市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)與其他2個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)相比晚疫病菌交配型相對單一，各地區(qū)之間不同交配型所占百分比具有明顯差異。

2.3　馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型分析

黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病菌菌株共鑒定出Ⅰa和Ⅱa 2種mtDNA單倍型，其中104株菌株為Ⅱa單倍型（82.5%），22株菌株為Ⅰa單倍型（17.5%）。從采集年份分析結(jié)果顯示，2015年測定的22株菌株中，共測定出19株Ⅱa單倍型菌株（86.4%），3株為Ⅰa單倍型菌株（13.6%）。2016年分離鑒定的32株菌株中，24株為Ⅱa單倍型菌株（75.0%），其余8株為Ⅰa單倍型菌株（25.0%）。2017年分離的72株菌株中，11株為Ⅰa單倍型菌株（15.3%），61株為Ⅱa單倍型菌株（84.7%）。2015年所鑒定菌株中Ⅱa單倍型比例最高。

從采集地區(qū)分析結(jié)果顯示，哈爾濱市采集分離的菌株均為Ⅱa單倍型（100%），綏化市分離的63株菌株中，共鑒定出Ⅰa和Ⅱa 2種單倍型，分別為15株（23.8%）和48株（76.2%）。齊齊哈爾市鑒定的53株菌株中，46株為Ⅱa單倍型（86.8%），7株為Ⅰa單倍型（13.2%）。可見哈爾濱市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)mtDNA單倍型單一，各地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌不同mtDNA單倍型所占比例具有明顯差異。

2.4　馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型分析

對黑龍江省采集分離的126株馬鈴薯晚疫病菌菌株進行SSR基因型分析，共鑒定出7種基因型，分 別 為 F-01、F-02、F-03、F-05、F-06、D-02和G-02。其中F-01基因型菌株共鑒定出98株（77.8%），F(xiàn)-05基因型為12株（9.5%），F(xiàn)-03基因型菌株為7株（5.5%），D-02基因型菌株為4株（3.2%），F(xiàn)-06基因型菌株為3株（2.4%），F(xiàn)-02基因型和G-02基因型分別鑒定出1株（0.8%）。

從采集年份來看（圖1），2015年分離鑒定的22株菌株中，共鑒定出3種基因型，分別為F-01、F-05和F-03。2016年共鑒定出5種基因型，分別為F01、F02、F03、F05、D02，其中F-01基因型菌株24株（75.0%），占比最高。2017年共鑒定出6種基因型?？梢姾邶埥●R鈴薯晚疫病菌SSR基因型多樣性逐年增加，F(xiàn)-01基因型為優(yōu)勢基因型，各年份間F-01基因型所占比例存在差異（圖1）。

圖1　采集年份與馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型關(guān)系

從采集地點來看（圖2），哈爾濱市采集分離的菌株只有F-01和D-02 2種基因型，分別占鑒定總菌株數(shù)的90.0%和10.0%。綏化市采集分離的菌株SSR基因型最多，有7種，其中F-01基因型47株（74.6%），占比最高。齊齊哈爾市共鑒定出5種SSR基因型（圖2）。

圖2　采集地區(qū)與馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型關(guān)系

2.5　馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型分析

根據(jù)mtDNA單倍型和SSR基因型，2015～2017年黑龍江省采集分離的菌株共劃分成9種multilocus基因型（表2），優(yōu)勢基因型均為multi-locus A基因型。其中2015年采集分離的馬鈴薯晚疫病菌共鑒定出4種multi-locus基因型，2016年共鑒定出7種multi-locus 基因型，其中multi-locus F基因型只在2016年分離的菌株中出現(xiàn)。2017年共鑒定出8種基因型。Multi-locus H基因型和multi-locus I基因型只在2017年分離的菌株中出現(xiàn)。Multi-locus基因型多樣性呈逐年增加的趨勢。

從表3可以看出，哈爾濱市采集分離的菌株鑒定出3種基因型，綏化市采集分離的菌株共鑒定出9種基因型，其中multi-locus F和multi-locus I基因型僅在綏化市出現(xiàn)。齊齊哈爾市采集分離的菌株中共鑒定出7種基因型。表明綏化市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌基因型更為豐富（表3）。

綜合上述multi-locus基因型和交配型結(jié)果，multi-locus基因型為A基因型的馬鈴薯晚疫病菌其交配型類型為A1、A2和自育型，基因型B和基因型D的馬鈴薯晚疫病菌其交配型類型為A1和A2。其余幾種multi-locus基因型的馬鈴薯晚疫病菌交配型都為A1。

表2　黑龍江省分離的馬鈴薯晚疫病菌采集年份與multi-locus基因型分析

表3　黑龍江省分離的馬鈴薯晚疫病菌采集地區(qū)與multi-locus基因型分析

3　結(jié)論與討論

3.1　馬鈴薯晚疫病菌交配型

馬鈴薯晚疫病菌是危害馬鈴薯、番茄等作物的一種卵菌綱致病真菌，2012～2013年馬鈴薯晚疫病在全國范圍內(nèi)偏重發(fā)生，發(fā)生范圍廣且流行快，對馬鈴薯造成嚴(yán)重危害（黃沖和劉萬才，2016）。

王鶴等（2012）對2009年在黑龍江省采集的菌株進行交配型檢測，結(jié)果表明鑒定菌株均為A1交配型。郭梅等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，2011～2012年在黑龍江省哈爾濱、綏化望奎縣、齊齊哈爾克山等地發(fā)現(xiàn)大量A2交配型馬鈴薯晚疫病菌菌株，2011年A2交配型占被測菌株的23.08%；2012年占被測菌株的30%。由此可見，黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型逐年復(fù)雜，但2014年后有關(guān)黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型方面的報道較少。本試驗對2015～2017年在黑龍江馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集分離出的晚疫病菌進行交配型測定，研究發(fā)現(xiàn)自育型菌株出現(xiàn)頻率逐年增加。從采集地點上發(fā)現(xiàn)哈爾濱市只有A1交配型菌株，綏化市和齊齊哈爾市出現(xiàn)3種交配型，說明與其他2個地區(qū)相比，哈爾濱市馬鈴薯晚疫病菌交配型較為單一。這一結(jié)論與郭梅等（2015）的研究結(jié)果基本一致。同時也說明綏化市和齊齊哈爾市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)有可能發(fā)生有性生殖，并導(dǎo)致馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性更加復(fù)雜化。

3.2　馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型和SSR基因型

通過測定馬鈴薯晚疫病菌基因型，可對晚疫病菌遺傳變異進行探究，為防治馬鈴薯晚疫病提供理論依據(jù)。本試驗對2015～2017年在黑龍江各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集的馬鈴薯晚疫病菌進行mtDNA單倍型鑒定，鑒定出Ⅰa和Ⅱa兩種單倍型。其中，Ⅱa單倍型為優(yōu)勢基因型，與張鉉哲等（2015）的研究結(jié)果一致，但未發(fā)現(xiàn)Ⅰb單倍型菌株。同時，本試驗對晚疫病菌進行SSR基因型測定，與李微（2015）對2012～2014年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型測定結(jié)果相比，鑒定出新的基因型F-06基因型。從分離年份上看，2017年黑龍江省晚疫病菌SSR基因型更為豐富，從采集地區(qū)方面分析，綏化市各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型更多樣化。

3.3　馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型

利用馬鈴薯晚疫病菌的交配型和multi-locus基因型，對馬鈴薯晚疫病菌的表現(xiàn)型和基因型進行系統(tǒng)綜合分析。本試驗中，2017年在黑龍江省采集分離的晚疫病菌multi-locus基因型最多，說明黑龍江省馬鈴薯晚疫病群體結(jié)構(gòu)逐年復(fù)雜。從分離地點分析，綏化市采集分離的馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型最為豐富。交配型與multi-locus基因型綜合分析結(jié)果表明，multi-locus A基因型、multi-locus B基因型和multi-locus D基因型與交配型沒有相關(guān)性，其余multi-locus 基因型與交配型相關(guān)。

哈爾濱市各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型多樣性較低，說明該地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌遺傳結(jié)構(gòu)較為簡單；而綏化市采集的馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型最多，表明該地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)更具多樣性。總體來說，2015～2017年黑龍江省各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)逐年復(fù)雜，給黑龍江省馬鈴薯晚疫病的防治帶來了新的挑戰(zhàn)。綏化市可能是黑龍江省馬鈴薯晚疫病的起源中心，未來該地區(qū)應(yīng)加強對馬鈴薯晚疫病的監(jiān)控。

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