金　曼， 蘇彥華

(1. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210008； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

沙冬青〔Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.〕隸屬于豆科(Fabaceae)沙冬青屬(AmmopiptanthusCheng f.)，是中國(guó)西北阿拉善荒漠地區(qū)特有的常綠闊葉灌木，也是第三紀(jì)殘遺物種，為稀有瀕危植物[1]。沙冬青主要分布區(qū)生境嚴(yán)酷，氣候干旱，年蒸發(fā)量為年降水量的20多倍；夏季酷熱，高溫可達(dá)35 ℃以上；冬季嚴(yán)寒，低溫可至-30 ℃～-20 ℃[2]。此外，沙冬青在固定流沙以及防止沙漠化方面有重要作用。鑒于沙冬青具有在嚴(yán)苛環(huán)境條件下生存的能力及在生態(tài)上的重要地位，可將其作為植物抗逆研究的重要材料。

目前已經(jīng)從沙冬青中分離克隆得到多個(gè)參與逆境脅迫的抗性相關(guān)基因，這些抗逆相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)可分為2大類：一類為具有保護(hù)作用的功能性蛋白質(zhì)，主要為與逆境脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)，如晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白AmLEA[3]和脫水素蛋白AmDHN[4]等；與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成和降解相關(guān)的酶類，如肌醇半乳糖苷合成酶AmGolS[5]和脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體AmProT[6]等；與植物毒性物質(zhì)降解、抗氧化防御能力相關(guān)的酶類，如超氧化物歧化酶AmSOD、谷胱甘肽過氧化物酶AmGPX以及抗壞血酸過氧化物酶AmAPX[7]等。另一類為參與逆境條件下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)，主要包括響應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)的磷酸酶AmCBL[8]，以及與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子AmDREB[9]和AmMYB[10]等。

轉(zhuǎn)錄因子是一類在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中具有十分重要作用的蛋白質(zhì)，在植物逆境響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用[11]。當(dāng)植物受到逆境脅迫后，轉(zhuǎn)錄因子與下游基因啟動(dòng)子部分特異性結(jié)合并對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的逆境應(yīng)答物質(zhì)含量以響應(yīng)逆境脅迫。由于轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中具有不可或缺的作用，在對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的研究中，當(dāng)前的研究熱點(diǎn)聚焦于轉(zhuǎn)錄因子及其與下游靶基因的識(shí)別與調(diào)控[11]。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以獲得大量的在逆境脅迫下的植物轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，并為篩選響應(yīng)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，以及為后續(xù)調(diào)控機(jī)制的研究提供充足的基因資源。

本研究對(duì)非生物脅迫處理前后沙冬青幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，以期為更深入地研究沙冬青響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制提供基因資源庫(kù)，并為進(jìn)一步鑒定下游的重要非生物響應(yīng)基因以及研究其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材料

沙冬青種子由甘肅民勤沙生植物園提供。將沙冬青種子用流動(dòng)的清水沖洗干凈后，挑取大小一致、籽粒飽滿的種子用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡30 s，無菌水清洗4～5次后，在黑暗條件下清水浸泡1 d，使種子充分吸脹。將吸脹的沙冬青種子轉(zhuǎn)移到鋪滿浸潤(rùn)無菌水的吸水紙的滅菌培養(yǎng)皿中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中遮光萌發(fā)催芽。3 d后，將發(fā)芽后長(zhǎng)勢(shì)基本一致的沙冬青幼苗轉(zhuǎn)移至塑料盒中，用改良的1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH 5.8)進(jìn)行培養(yǎng)[6]，每隔2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。

對(duì)在1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)3周的沙冬青幼苗進(jìn)行質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)18%聚乙二醇6000(PEG 6000)模擬的干旱脅迫以及100 mmol·L-1NaCl模擬的鹽脅迫。分別于脅迫1、6、12、24和48 h對(duì)地上部和地下部的組織取樣，并以脅迫0 h的樣品為對(duì)照，將樣品用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2　轉(zhuǎn)錄因子分析及差異表達(dá)基因選擇

沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于作者所在實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用RNAiso Plus試劑〔寶生物工程(大連)有限公司〕分別提取正常培養(yǎng)3周以及質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)18%聚乙二醇6000處理6 h的沙冬青幼苗地上部和地下部的總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)對(duì)上述樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)量控制過濾去除無效序列，拼接后得到44 959條沙冬青unigenes序列，以fasta格式保存。

利用InterProScan軟件(http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)和PlnTFDB 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http：∥plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)對(duì)沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中拼接獲得的unigenes進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。通過Hmmsearch軟件搜尋植物轉(zhuǎn)錄因子基因的保守域，并將具有這些植物轉(zhuǎn)錄因子基因保守域的unigenes歸類到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因家族中。通過RPKM(reads per kilobase per million reads)法計(jì)算沙冬青unigenes的表達(dá)豐度(RPKM值)，根據(jù)在干旱脅迫處理?xiàng)l件與對(duì)照條件下基因的表達(dá)豐度計(jì)算其表達(dá)量的差異[12]。將表達(dá)量差異倍數(shù)大于等于2倍的轉(zhuǎn)錄因子視為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。

1.3　總RNA提取及熒光定量PCR

采用RNAiso Plus試劑〔寶生物工程(大連)有限公司〕分別提取經(jīng)干旱脅迫和NaCl脅迫的沙冬青幼苗地上部和地下部的總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書合成第1鏈cDNA，用于后續(xù)基因定量表達(dá)分析。通過Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)6個(gè)在轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)的AmbHLH基因的熒光定量PCR引物，引物序列見表1，并以編號(hào)為comp62392的基因(AmeIF1)[7]作為沙冬青的內(nèi)參基因，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)SYBR?PremixExTaqTM試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書，在Bio-Rad CFX-96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包含SYBRPremixExTaq10.0 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL、ddH2O稀釋5倍后的cDNA 5.0 μL及ddH2O 4.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法[13]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1用于沙冬青AmbHLH基因熒光定量PCR擴(kuò)增的引物序列

Table1PrimersequencesusedforfluorescencequantitativePCRamplificationofAmbHLHgenesfromAmmopiptanthusmongolicus(Maxim.exKom.)Chengf.

基因編號(hào)GeneID正向引物序列(5'→3')Sequenceofforwardprimer(5'→3')反向引物序列(5'→3')Sequenceofreverseprimer(5'→3')comp62392(AmeIF1)CTGACATGCGCCGTAGGAACGCCCTGCTTATGCCAGTCTTTTcomp55415TGCAGCATCAAGTGGAGTTCTCATCAACTGGCAACTACT-TCTcomp38040ATTGCTCAGATGGGCGAAGGATGTAGCCGTGCGTAGTGTCcomp58250TGACTTGTCCATCATCTG-GTTTGAGGAGGCTTAGCCATAGACACcomp64918.1GATTTGCTCGCATCACTGGGGGAACAGTGTGACACCAGACAcomp64918.2GCTCATTGACGCCAAATTCTTGGTCTGCGGGTACAAAACAcomp65919AAGAGATGGTTCCCGCTTGGTCTGGAGGGTTTATCCCCGT

2　結(jié)果和分析

2.1　干旱脅迫下沙冬青轉(zhuǎn)錄因子基因鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接的unigenes進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析，結(jié)果表明：沙冬青中共有1 575個(gè)unigenes(即1 575個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)，歸類到49個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族(圖1)。在沙冬青各轉(zhuǎn)錄因子基因家族中基因數(shù)最多的為MYB基因家族，共有222個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因；之后依次為AP2-EREBP基因家族(144個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)、bHLH基因家族(114個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)、DBP基因家族(106個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)、NAC基因家族(82個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)和WRKY基因家族(79個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因)。

圖1　沙冬青轉(zhuǎn)錄因子基因家族分類Fig. 1　Classification of transcription factor gene families from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f.

2.2　干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因分析

干旱脅迫下沙冬青地上部共有44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)，其中，33個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)，11個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因下調(diào)表達(dá)；地下部共有57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)，其中，50個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達(dá)，7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因下調(diào)表達(dá)(表2)。NAC基因家族中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因的數(shù)量最多，地上部和地下部分別有8和9個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因；之后依次為AP2-EREBP基因家族(地上部和地下部分別有6和9個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因)、MYB基因家族(地上部和地下部均有7個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因)和WRKY基因家族(地上部和地下部分別有7和2個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因)。

干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量差異倍數(shù)的分布情況見圖2。由圖2可以看出：干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因在地上部和地下部的表達(dá)模式不同，地上部表達(dá)量的差異倍數(shù)為2～5倍的轉(zhuǎn)錄因子基因最多，而地下部表達(dá)量的差異倍數(shù)為5(含5)～10(含10)倍的轉(zhuǎn)錄因子基因最多。在地上部，表達(dá)量的差異倍數(shù)在10(含10)倍以內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子基因有35個(gè)，占地上部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的79.5%。其中，表達(dá)量上(下)調(diào)2～5倍的轉(zhuǎn)錄因子基因有23個(gè)，占地上部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的52.3%；表達(dá)量上(下)調(diào)5(含5)～10(含10)倍的轉(zhuǎn)錄因子基因有12個(gè)，占地上部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的27.3%。表達(dá)量的差異倍數(shù)在10倍以上的轉(zhuǎn)錄因子基因有9個(gè)，占地上部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的20.5%。

表2干旱脅迫下沙冬青地上部和地下部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因分析1)

Table2Analysesondifferentiallyexpressedtranscriptionfactorgenesfromabove-andunder-groundpartsofAmmopiptanthusmongolicus(Maxim.exKom.)Chengf.underdroughtstress1)

轉(zhuǎn)錄因子基因家族Transcriptionfactorgenefamily地上部Above-groundpart地下部Under-groundpartNUNDNUNDNAC8090AP2-EREBP3390MYB6170WRKY7011DBP3050bHLH1032GRAS0130HSF2020C2C2-GATA0201C3H1110OFP1010C2C2-YABBY0100CPP0100mTERF0100SBP1000ABI3VP10020C2C2-Dof0011LOB0020MADS0011LIM0001Sigma70-like0010TCP0010zf-HD0010合計(jì)Total3311507

1)NU： 上調(diào)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)Number of up-regulated differentially expressed transcription factor genes； ND： 下調(diào)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)Number of down-regulated differentially expressed transcription factor genes.

□： 地上部Above-ground part； ： 地下部Under-ground part. FC： 差異倍數(shù)Fold change. Ⅰ： -10≤FC≤-5； Ⅱ： -510. 負(fù)數(shù)表示基因下調(diào)表達(dá)，正數(shù)表示基因上調(diào)表達(dá)The negative numbers mean down-regulated expression of genes， and the positive numbers mean up-regulated expression of genes.圖2　干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的差異倍數(shù)分布Fig. 2　Distribution of fold change of expression level of differentially expressed transcription factor genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

在地下部，表達(dá)量的差異倍數(shù)在10(含10)倍以內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子基因有38個(gè)，占地下部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的66.7%。其中，表達(dá)量上(下)調(diào)2～5倍的轉(zhuǎn)錄因子基因有14個(gè)，占地下部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的24.6%；表達(dá)量上(下)調(diào)5(含5)～10(含10)倍的轉(zhuǎn)錄因子基因有24個(gè)，占地下部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的42.1%。表達(dá)量的差異倍數(shù)在10倍以上的轉(zhuǎn)錄因子基因有19個(gè)，占地下部差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因總數(shù)的33.3%。

2.3　干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析

bHLH類轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中起著重要的調(diào)控作用。對(duì)沙冬青轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：沙冬青中存在114個(gè)bHLH基因，當(dāng)受到干旱脅迫后，表達(dá)量的差異倍數(shù)大于等于2倍的bHLH基因有6個(gè)。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中對(duì)這6個(gè)bHLH基因進(jìn)行搜索，獲得各基因序列開放閱讀框的全長(zhǎng)，這6個(gè)bHLH基因在轉(zhuǎn)錄組中的編號(hào)分別為comp64918.1、comp64918.2、comp55415、comp58250、comp65919和comp38040。利用NCBI的BLASTp軟件對(duì)這6個(gè)bHLH基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析結(jié)果表明：這6個(gè)bHLH基因編碼的氨基酸序列與擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕bHLH基因編碼的氨基酸序列有不同程度的相似性。

對(duì)沙冬青中6個(gè)差異表達(dá)bHLH基因和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析(圖3)。結(jié)果顯示：沙冬青中編號(hào)為comp55415的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號(hào)為AT1G73830.1的基因(BEE3，BRenhancedexpression3)編碼的氨基酸序列的相似度為46%，編號(hào)為comp38040的基因編碼的氨基酸序列與編號(hào)為AT4G37850.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為41%，編號(hào)為comp58250的基因編碼的氨基酸序列與編號(hào)為AT1G10120.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為42%，編號(hào)為comp64918.1和comp64918.2的基因編碼的氨基酸序列與編號(hào)為AT3G43790.3的基因(ZIFL2，zincinducedfacilitator-like2)和編號(hào)為AT5G13750.1的基因(ZIFL1，zincinducedfacilitator-like1)編碼的氨基酸序列的相似度較高，相似度分別為54%和59%，編號(hào)為comp65919的基因編碼的氨基酸序列與編號(hào)為AT4G34530.1的基因(CIB1，cryptochrome-interactingbasic-helix-loop-helix1)編碼的氨基酸序列的相似度可達(dá)55%。

AT4G37850.1，AT1G10120.1，AT1G73830.1，AT4G34530.1，AT5G13750.1，AT3G43790.3： 擬南芥bHLH基因的編號(hào)ID of bHLH genes from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 沙冬青bHLH基因的編號(hào)ID of bHLH genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f.圖3　干旱脅迫下沙冬青差異表達(dá)bHLH基因和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列的聚類分析Fig. 3　Cluster analysis on amino acid sequences encoded by differentially expressed bHLH genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress and bHLH genes from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.4　干旱脅迫和NaCl脅迫下沙冬青差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式

通過熒光定量PCR對(duì)干旱脅迫和NaCl脅迫下沙冬青地上部和地下部6個(gè)差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果分別見圖4至圖7。

由圖4可以看出：隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，沙冬青地上部差異表達(dá)bHLH基因的相對(duì)表達(dá)量略有波動(dòng)，除編號(hào)為comp55415的基因的相對(duì)表達(dá)量在干旱脅迫1 h明顯提高外，其他5個(gè)差異表達(dá)bHLH基因的相對(duì)表達(dá)量總體上低于2.0。

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號(hào)Gene ID.圖4　干旱脅迫下沙冬青地上部差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式Fig. 4　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from above-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號(hào)Gene ID.圖5　干旱脅迫下沙冬青地下部差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式Fig. 5　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from under-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號(hào)Gene ID.圖6　NaCl脅迫下沙冬青地上部差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式Fig. 6　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from above-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under NaCl stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號(hào)Gene ID.圖7　NaCl脅迫下沙冬青地下部差異表達(dá)bHLH基因的表達(dá)模式Fig. 7　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from under-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under NaCl stress

由圖5可以看出：隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，沙冬青地下部編號(hào)為comp58250和comp65919的基因的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢(shì)，在干旱脅迫處理后期，這2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量略高于對(duì)照；編號(hào)為comp64918.1、comp64918.2和comp55415的基因的相對(duì)表達(dá)量總體上高于對(duì)照；而編號(hào)為comp38040的基因的相對(duì)表達(dá)量在干旱脅迫處理前期高于對(duì)照，在干旱脅迫處理后期低于對(duì)照。此外，編號(hào)為comp64918.1、comp64918.2和comp55415的基因的相對(duì)表達(dá)量在干旱脅迫6 h達(dá)到峰值，編號(hào)為comp380405的基因的相對(duì)表達(dá)量在干旱脅迫1 h達(dá)到峰值。

由圖6可以看出：隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，沙冬青地上部編號(hào)為comp65919和comp38040的基因的相對(duì)表達(dá)量略有下降；編號(hào)為comp64918.2、comp55415和comp58250的基因的相對(duì)表達(dá)量總體上升高；而編號(hào)為comp64918.1的基因的相對(duì)表達(dá)量在NaCl脅迫12 h高于對(duì)照并達(dá)到峰值，在其他脅迫時(shí)間則低于對(duì)照。

由圖7可以看出：隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，沙冬青地下部編號(hào)為comp64918.1、comp64918.2、comp55415和comp38040的基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，均在NaCl脅迫6 h達(dá)到峰值；編號(hào)為comp58250和comp65919的基因的相對(duì)表達(dá)量無顯著變化，均在NaCl脅迫12 h降至最低。

3　討　　論

轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫的過程中起重要的調(diào)控作用，通過調(diào)控下游功能基因的表達(dá)，從而顯著增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受能力。沙冬青是一種古老的沙漠植物，在逆境脅迫條件下具有很強(qiáng)的抗逆能力，是挖掘植物抗逆相關(guān)基因的優(yōu)質(zhì)物種。本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示：干旱脅迫下沙冬青NAC、AP2-EREBP、MYB、WRKY和bHLH基因家族的差異表達(dá)基因數(shù)較多，說明這些基因在響應(yīng)干旱脅迫的過程中起到重要作用。

在質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)18%聚乙二醇6000模擬的干旱脅迫條件下處理6 h，沙冬青中數(shù)個(gè)包含NAC和MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)。大量研究結(jié)果表明：NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及次生壁合成等生物過程，在逆境應(yīng)答響應(yīng)過程中具有重要功能[14-15]。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及在響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16-17]。本研究結(jié)果表明：沙冬青在受到干旱脅迫后，其地上部和地下部分別有8和9個(gè)NAC基因表達(dá)量上調(diào)，以及6和7個(gè)MYB基因表達(dá)量上調(diào)。這2類轉(zhuǎn)錄因子家族基因在沙冬青受到干旱脅迫后響應(yīng)強(qiáng)烈，說明其參與了沙冬青干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控過程。

AP2-EREBP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，可分為AP2和EREBP 2個(gè)亞家族[18]。AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物逆境響應(yīng)過程的調(diào)控，進(jìn)而提高植物對(duì)逆境的耐受能力[19]。本研究認(rèn)為，沙冬青地上部有6個(gè)AP2-EREBP基因在受到干旱脅迫后差異表達(dá)，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子基因各有3個(gè)；地下部有9個(gè)AP2-EREBP基因表達(dá)量上調(diào)。AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族不同基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)不同的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)模式，表明該轉(zhuǎn)錄因子家族中不同成員在干旱脅迫響應(yīng)過程中的調(diào)控方式存在差異。

本研究中，沙冬青地上部有7個(gè)WRKY基因表達(dá)量上調(diào)，地下部有2個(gè)WRKY基因差異表達(dá)，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的WRKY基因各1個(gè)，說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在沙冬青干旱脅迫響應(yīng)過程中起到重要作用。通常，一個(gè)WRKY基因能夠響應(yīng)多種脅迫條件，進(jìn)而對(duì)不同的生理過程進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控[20]。研究結(jié)果表明：在NicotianabenthamianaDomin中過表達(dá)GhWRKY17基因可增強(qiáng)N.benthamiana對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受能力[21]，但是在水稻(OryzasativaLinn.)中過表達(dá)OsWRKY45基因則導(dǎo)致水稻對(duì)鹽脅迫更為敏感[22]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，其不僅參與了植物體內(nèi)一系列的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過程[23-25]，而且在植物響應(yīng)干旱[26-27]、高鹽[28-29]、脫落酸[30]、低溫[31]、缺鐵[32]和低磷[33]等非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示：沙冬青bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中有114個(gè)基因，其中有6個(gè)bHLH基因在干旱脅迫處理下表達(dá)量的差異倍數(shù)大于等于2倍。這6個(gè)bHLH基因不僅在干旱脅迫下差異表達(dá)，而且在NaCl脅迫下的表達(dá)也受到不同程度的誘導(dǎo)。將沙冬青6個(gè)bHLH基因(編號(hào)分別為comp64918.1、comp64918.2、comp55415、comp58250、comp65919和comp38040)和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示：根據(jù)氨基酸序列的相似度，編號(hào)為comp55415的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號(hào)為AT1G73830.1的基因(BEE3)編碼的氨基酸序列最為相似，而編號(hào)為AT1G73830.1的基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)[34]。此外，編號(hào)為comp58250的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號(hào)為AT1G10120.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為42%，編號(hào)為comp65919的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號(hào)為AT4G34530.1的基因(CIB1)編碼的氨基酸序列的相似度為55%。擬南芥中編號(hào)為AT1G10120.1和AT4G34530.1的基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄因子均參與藍(lán)光信號(hào)響應(yīng)過程，調(diào)控花周期開放[35-36]。而與編號(hào)為comp38040的基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄因子最為相似的擬南芥中編號(hào)為AT4G37850.1的基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯和生長(zhǎng)素的響應(yīng)過程[37]，從而調(diào)控逆境脅迫的響應(yīng)。編號(hào)為comp64918.1和comp64918.2的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號(hào)為AT3G43790.3的基因(ZIFL2)和編號(hào)為AT5G13750.1的基因(ZIFL1)編碼的氨基酸序列的相似度最高，編號(hào)為AT3G43790.3和AT5G13750.1的基因與擬南芥體內(nèi)鉀離子的平衡相關(guān)，參與調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)，從而增強(qiáng)擬南芥的抗旱性能[38-39]。

本研究結(jié)果可為沙冬青干旱脅迫調(diào)控機(jī)制研究提供龐大的轉(zhuǎn)錄因子基因資源，然而，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因在干旱脅迫響應(yīng)中的功能還未明確，其調(diào)控的下游基因及其結(jié)合位點(diǎn)，以及對(duì)下游靶基因的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

4　結(jié)　　論

對(duì)沙冬青轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果表明：沙冬青中存在49個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，共有1 575個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因。當(dāng)受到質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)18%聚乙二醇6000模擬的干旱脅迫處理6 h后，沙冬青地上部有44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)，地下部有57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因差異表達(dá)。bHLH基因家族中6個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)Ω珊得{迫以及NaCl脅迫有不同程度的響應(yīng)，說明其在逆境脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。

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