黨亞麗 周亭屹

摘 要：目的是建立一種快速檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的液相芯片檢測(cè)方法。采用基于間接競(jìng)爭(zhēng)法的原理，將3種細(xì)菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯(lián)，以藻紅蛋白（PE）熒光標(biāo)記二抗為信號(hào)，優(yōu)化反應(yīng)條件，對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度、特異性和可重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，3種細(xì)菌檢測(cè)抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng，建立的方法檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的最低檢測(cè)限均可達(dá)到103 CFU/mL，檢測(cè)其他常見(jiàn)食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)論表明，建立了一種快速檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測(cè)方法，能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?副溶血弧菌 沙門(mén)氏菌 液相芯片 檢測(cè)

前言

近年來(lái)，食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問(wèn)題，病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質(zhì)、生熟交叉污染等原因引起，且氣溫較高、氣候潮濕的環(huán)境適于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致食物易于腐敗變質(zhì)，一旦儲(chǔ)存、加工不當(dāng)，極易發(fā)生由沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒?，F(xiàn)行檢測(cè)手段已無(wú)法滿足日常對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的需要，目前檢驗(yàn)檢疫工作中常用于檢測(cè)和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法[ 2 ]?，F(xiàn)行的檢測(cè)方法一般以檢測(cè)致病菌為主，需要增菌培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法滿足高通量的檢測(cè)要求，遠(yuǎn)不能滿足食品檢測(cè)的需要，市場(chǎng)迫切需要能同時(shí)檢測(cè)食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷的高通量技術(shù)和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)和追蹤病原體和污染物的來(lái)源[4]。

液相芯片技術(shù)是在流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的新一代生物芯片技術(shù)和新型蛋白質(zhì)研究平臺(tái)，能同時(shí)檢測(cè)多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過(guò)該法建立了對(duì)沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)到50～100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對(duì)金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測(cè)方法，具有很好的特異性，檢測(cè)靈敏度分別達(dá)38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時(shí)檢測(cè)6種食源性致病菌的方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)到20.4×103CFU/mL，遠(yuǎn)高于PCR。

但基于多重PCR的液相芯片技術(shù)對(duì)單管樣本進(jìn)行大量不同指標(biāo)的高通量多重PCR方法建立仍存在困難，至今鮮見(jiàn)液相芯片用于檢測(cè)多種致病菌方法建立的相關(guān)報(bào)道。將液相芯片技術(shù)應(yīng)用到食源性致病菌檢測(cè)中，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種致病菌靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)，因而有望大大提高食源性致病菌的檢測(cè)效率，在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國(guó)Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；編號(hào)No.18、No.29、No.52的微球（美國(guó)Luminex公司）?；罨彌_液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗滌緩沖液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析緩沖液：PBS，1%BSA，pH7.4；封閉緩沖液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；儲(chǔ)存緩沖液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%疊氮化鈉，pH7.4。菌種為本實(shí)驗(yàn)室保藏與西北農(nóng)林科技大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 微球偶聯(lián)抗原

①取微球50μL（1.25×106個(gè)/mL）置于EP管，14000g離心4min，棄上清液。

②加入40μL活化緩沖液重懸微球，漩渦混合30s。

③加入50mg/mL NHS和EDC各5μL，混勻，避光室溫下旋轉(zhuǎn)混合600rpm，20min。

④加入150μL PBS，漩渦混合10s，14000g離心4min，棄上清液。

⑤用PBS洗滌3次后，加入150μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補(bǔ)齊至500μL，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，2h。

⑥14000g離心4min，棄上清液。

⑦加入150μL封閉緩沖液，漩渦混合15s，避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm，30min。

⑧16000g離心4min，棄上清液，加入100μL儲(chǔ)存緩沖液4℃保存偶聯(lián)的微球?？乖尤肓繛?0ng。1.2.2 檢測(cè)

①取出偶聯(lián)微球，恢復(fù)至室溫后漩渦30s。

②96孔板中加入100μL PBS預(yù)濕實(shí)驗(yàn)孔，抽去孔內(nèi)液體，每孔中加入適量預(yù)混好的偶聯(lián)微球（約2000個(gè)），用150μL PBS洗滌兩次。

③將適量標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的抗體，用PBS補(bǔ)齊各孔至100μL。

④用移液器反復(fù)抽吸混勻孔內(nèi)溶液，避光條件下37℃，600rpm振蕩60min。

⑤反應(yīng)完畢后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑥每孔中加入100μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的PE標(biāo)記二抗，移液器反復(fù)抽吸混勻。

⑦避光條件下，37℃，600rpm振蕩45min后，抽去孔內(nèi)液體，用150μL PBS洗滌兩次。

⑧加入100μL PBS，900rpm震蕩3min重懸浮微球并混勻，置于液相芯片系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，每種微球讀取100個(gè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1 最佳抗體加入量的確定

在不加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，分別加入對(duì)應(yīng)抗體1、5、10、20和40ng，加入過(guò)量的PE標(biāo)記二抗，采用液相芯片系統(tǒng)測(cè)試。

1.3.2 單一標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

3種標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的比例稀釋成梯度液，采用液相芯片系統(tǒng)測(cè)試。按照ELISA所采用的抑制率計(jì)算方式（抑制率B=（A0-An）/A0，其中A0為不加樣品孔MFI值；An為加標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品孔MFI值），將各孔MFI值換算成抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立單一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 靈敏度

用PBS緩沖液將培養(yǎng)的菌10倍系列稀釋，取1 08～102CFU/mL用已建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證該方法的靈敏度。

1.3.4 特異性

用已建立的方法檢測(cè)7種常見(jiàn)的食源性致病菌，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.3.5 重復(fù)性

在1d、5d、7d用此方法分別檢測(cè)陽(yáng)性菌和陰性菌，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體加入量?jī)?yōu)化

如圖1所示，低濃度時(shí)，隨著抗體加入量的增加，MFI值迅速升高?？贵w量增大至一定值后，種抗體的MFI值均趨于平穩(wěn)，此時(shí)抗原的位點(diǎn)已被全部占據(jù)。選擇MFI的拐點(diǎn)為最佳抗體加入量，因?yàn)榇藭r(shí)靶標(biāo)物和探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合獸藥抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果變化最顯著。單增李斯特菌、副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌抗體加入量分別為10ng、10ng、5ng。

2.2 一元標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

在加入最優(yōu)抗體量的條件下，建立了一元標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率與抗原濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。單增李斯特菌方程為y=0.1935ln（x）-0.2924，R2=0.9869，副溶血弧菌方程為y=0.1748ln（x）+0.2054，R2=0.9909，沙門(mén)氏菌方程為y=0.2469ln（x）-0.1658，R2=0.9887。

2.3 靈敏度檢測(cè)

由圖3可看出，三種細(xì)菌在濃度達(dá)到103CFU/mL時(shí)仍可被檢出。因此本方法的靈敏度較高，可達(dá)到103CFU/mL。

2.4 特異性的檢測(cè)

用已建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，從圖4中可看出此方法特異性良好，與其它菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

在1d、5d、7d用此方法分別檢測(cè)陽(yáng)性菌和陰性菌，由圖5可見(jiàn)陽(yáng)性菌，陰性菌MFI值上下浮動(dòng)都不大，可證明本方法重復(fù)性較好。

3 結(jié)論

2001年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)液相芯片技術(shù)可應(yīng)用于臨床診斷，這是唯一由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。目前，液相芯片技術(shù)已應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、自身免疫性疾病診斷等方面。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)食品中的病原微生物，需先對(duì)可疑樣品增菌1～2d，然后接種于平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，之后再進(jìn)行生化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，所需材料和試劑繁多，而且分型鑒定等需有經(jīng)驗(yàn)的人員來(lái)完成；使用PCR檢測(cè)病原體也存在一定缺陷，特別是在大量樣本的檢測(cè)中，單一PCR費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而多重PCR體系尚不成熟，擴(kuò)增背景高，靈敏度和特異性較低。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種應(yīng)用液相芯片技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的方法。由于整個(gè)反應(yīng)過(guò)程完全在液相環(huán)境中進(jìn)行，故靈敏度較高，可達(dá)到103CFU/mL；該方法特異性好，檢測(cè)選擇的幾種常見(jiàn)食源性致病菌，特異性可達(dá)100%。與傳統(tǒng)方法相比，本方法耗時(shí)短，4h即可完成檢測(cè)；需要樣品量少，只需10 μL的菌液。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的液相芯片技術(shù)，其為一種優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的快速、準(zhǔn)確、高通量的新型檢測(cè)技術(shù)，在食品檢驗(yàn)檢疫方面具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。該方法的建立也為其他致病菌快速、高通量檢測(cè)提供了參考。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項(xiàng)目（項(xiàng)目號(hào)：2014C02023）。