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(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，　貴州 貴陽(yáng) 550025)

黨參為我國(guó)著名的常用大宗藥材，為桔?？泣h參屬植物黨參(Codonopsispilosula)、川黨參(C.tangshen)和素花黨參(C.pilosulavar.modesta)的干燥根[1]。因黨參藥食兩用和獨(dú)特的功效越來(lái)越受到世人的青睞，近年來(lái)已成為用量最多的中藥材品種之一。黨參屬(Codonopsis)植物種類繁多，分類鑒定較為困難。除了藥典規(guī)定的3個(gè)來(lái)源，同屬多種植物的根也常常混為黨參使用，甚至是金錢豹屬(Campanumoea)植物的根在貴州等地區(qū)也作為“土黨參”使用[2]。黨參藥材常常被加工炮制成飲片或以粉末入藥，其性狀特征發(fā)生了較大變化，采用傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別較為困難。

自2003年Hebert[3]首次提出DNA條形碼(DNA barcoding)概念以來(lái)，該技術(shù)已成為近年來(lái)發(fā)展最快，研究最熱的一門新興技術(shù)。其通過(guò)對(duì)所獲得的一條或幾條DNA片段進(jìn)行大范圍地掃描，構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)[4]，通過(guò)比較物種中的一條或少數(shù)幾條通用的DNA片段就能夠?qū)ξ锓N進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定，具有簡(jiǎn)便、快速、可信的巨大優(yōu)勢(shì)。Kress和Erickson研究認(rèn)為，rbcL和psbA-trnH適合植物鑒定[5]。同年，Chase和Cowan等提出，rpoC1、rpoB和matK組合或rpoC1、matK與psbA-trnH組合可用于植物鑒定[6]。Lahaye[7]對(duì)蘭科植物進(jìn)行了研究，提出了matK可以鑒定隱藏新物種的觀點(diǎn)。2009年P(guān)lant Working Group[8]提出matK和rbcL組合鑒定植物。2010年Chen等對(duì)6 000余份植物樣品進(jìn)行了DNA條形碼篩選，結(jié)果表明，ITS 2鑒定效率優(yōu)于matK和rbcL組合[9]。鑒于黨參類藥材鑒定較為困難，對(duì)黨參屬和金錢豹屬11個(gè)物種53份樣品的psbA-trnH、rbcL、matK及ITS 2序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和Barcoding gap分析，比較各序列的擴(kuò)增和測(cè)序效率，種內(nèi)和種間變異，并采用BLAST 1和Nearest Distance方法評(píng)價(jià)不同序列的鑒定能力，以期為該類植物及藥材的分類鑒定提供新的參考依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1　實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀(9700，美國(guó)ABI公司)；低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5810 R，德國(guó)Eppendof公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GGM/D 2，英國(guó)SYNGENE)；電泳儀(DYY-6 C，北京六一儀器廠)；自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(ES-315，深圳市博大精科技實(shí)業(yè)有限公司)；微型漩禍混合儀(WH-1，常州易晨?jī)x器制造有限公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP-320離心柱型，Tiangen公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；2×TapPCR MasterMix(KT 201，Tiangen公司)；Marker(D 2000，Tiangen公司)；5×TBE電泳緩沖液(SD 8102，上海生工生物工程有限公司)；Goldview I型核酸染色試劑(D 0125，Solarbio)；瓊脂糖(SunShineBio，南京生興生物技術(shù)有限公司)。

1.3　實(shí)驗(yàn)樣品

本研究所有樣品均采集于貴州省、云南省、四川省，共53份，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表1。

表1樣品來(lái)源

種名產(chǎn)地采集日期(年/月/日)憑證標(biāo)本黨參黨參Codonopsispilosula貴州威寧縣2013/05/10ZY130510管花黨參C．tubulosa貴州赫章縣2013/05/31ZY130531雞蛋參C．convolvulacea云南宣威縣2013/08/03ZY130803銀背葉黨參C．a(chǎn)rgentea貴州江口縣2014/08/20ZY140820川黨參C．tangshen貴州威寧縣2013/08/01ZY130801素花黨參C．pilosulavar．modesta貴州威寧縣2013/08/02ZY130802小花黨參C．micrantha貴州威寧縣2013/08/02ZY140802羊乳C．lanceolata四川峨眉山2014/06/10ZY140610大花金錢豹Campanumoeajavanica貴州紫云縣2014/09/20ZY140920金錢豹Cam．javanicasubsp．japonica貴州貴陽(yáng)市2014/09/14ZY140914長(zhǎng)葉輪鐘草Cam．lancifolius貴州貴陽(yáng)市2013/05/20ZY130520

2　方法與結(jié)果

2.1　實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1總DNA提取、凝膠電泳、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

選取硅膠干燥的植物葉片約20 mg，采用試劑盒提取總DNA。PCR反應(yīng)體系50μL，體系包含2μL總DNA(約30 ng)、26μL 2×TapPCR MasterMix、引物2μL(2.5μmol/L)和20μL ddH2O。各個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增引物及擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以Marker作為標(biāo)記于1.2%的凝膠板上電泳30 min檢測(cè)，于凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察，拍照(見(jiàn)圖1)，將獲得的單一明亮條帶產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.1.2數(shù)據(jù)處理

測(cè)序峰圖采用序列拼接軟件CodonCode AlignerV 5.12(CodonCode Co.，USA)校對(duì)拼接，去掉引物區(qū)及低質(zhì)量區(qū)，所得各序列經(jīng)MEGA 5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)、查錯(cuò)；采用 PCR 擴(kuò)增效率和測(cè)定成功率評(píng)價(jià)各個(gè)分子標(biāo)記的擴(kuò)增及測(cè)序情況；利用Song等[10]的方法，計(jì)算遺傳距離K 2 P值，比較不同標(biāo)記基因在種間、種內(nèi)變異幅度，最后采用Ross等[11]的比對(duì)法和最小距離法考察標(biāo)記基因的鑒定效率。

表2各引物名稱、擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系

標(biāo)記基因引物名引物序列5′?3′擴(kuò)增條件反應(yīng)體系ITS22FGCGATACTTGGTGTGAAT3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃45s，40cycles，72℃10minMix13μL，引物1μL，總DNA1μL，ddH2O9μLpsbA?trnHfwdGTTATGCATGAACGTAATGCTCrevCGCGCATGGTGGATTCACAATCC94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃45s，30cycles，72℃1minMix13μL，引物1μL，總DNA1μL，ddH2O9μLmatK3F＿KIMCGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG1R＿KIMACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC95℃4min，94℃30s，56℃45s，72℃45s，35cycles，72℃10minMix13μL，引物1μL，總DNA3μL，ddH2O7μLrbcLLACGTAGCTTATCCTTTAGACCHTGGCATAGAGACCCAATCTT94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃45s，30cycles，72℃1minMix13μL，引物1μL，總DNA3μL，ddH2O7μL

圖1　DNA序列部分電泳圖

2.2　結(jié)　果

2.2.1PCR擴(kuò)增及測(cè)序率、序列長(zhǎng)度及GC含量

PCR擴(kuò)增率和測(cè)序率是評(píng)價(jià)DNA條形碼序列的一個(gè)重要指標(biāo)。各序列擴(kuò)增率均為100%。測(cè)序率除了matK為96.5%外，其余測(cè)序率為100%。序列長(zhǎng)度考察發(fā)現(xiàn)，matK最長(zhǎng)，其余依次是rbcL、ITS 2和psbA-trnH。同時(shí)ITS 2和psbA-trnH序列長(zhǎng)度在種間和種內(nèi)差異較大。rbcL在種間和種內(nèi)有一定變化，matK序列長(zhǎng)度幾乎無(wú)變化，詳見(jiàn)表3。

2.2.2種內(nèi)及種間變異分析

最理想的條形碼是種內(nèi)最大遺傳變異應(yīng)小于種間最小遺傳變異，并且兩者之間有顯著差異。分析序列種間和種內(nèi)變異情況，結(jié)果表明，ITS 2種間變異最大，其余依次是matK、psbA-trnH和rbcL，且ITS 2和matK明顯大于psbA-trnH和rbcL。種內(nèi)變異不大，依次是matK、rbcL、ITS 2和psbA-trnH，詳見(jiàn)表4。

2.2.3不同序列Barcoding gap分析

一條理想的DNA條形碼是種間差異足夠大，種內(nèi)差異盡量小，并且在兩者間形成一個(gè)間隔區(qū)。從Barcoding gap種間、種內(nèi)的分布圖來(lái)看，4條DNA條序列的Barcoding gap均不明顯，種間、種內(nèi)變異分布呈一邊分散趨勢(shì)，不利于該類植物鑒定，見(jiàn)圖2。

表3DNA序列長(zhǎng)度及GC含量

項(xiàng)目ITS2psbA?trnHmatKrbcLPCR擴(kuò)增率(%)100100100100測(cè)序率(%)10010096．5100序列范圍(均值)bp437～508(479)336～450(376)820～837(829．2)677～716(708．2)GC含量范圍(均值)%56．3～60．4(58．5)33．8～39．1(37．2)34．7～36．2(35．5)20．1～23．4(21．2)

表44個(gè)序列種間種內(nèi)差異

項(xiàng)目ITS2psbA?trnHmatKrbcL種內(nèi)變異0．2325±0．31540．1087±0．20930．2770±0．24620．2338±0．2452θ0．5041±0．65560．2174±0．39620．5657±0．48250．5862±0．5566平均溯祖度0．1427±0．40190．0867±0．26470．3383±0．44810．2558±0．4525種間變異0．6862±0．30960．2214±0．15810．4383±0．23630．1949±0．2738θ’0．0205±0．02540．0206±0．02670．0132±0．01660．0068±0．0069種間最小變異0．7627±0．63580．1890±0．35430．4099±0．45200．2991±0．4638

圖2　DNA條序列的Barcoding gap

2.2.4候選序列鑒定率評(píng)價(jià)

采用對(duì)比法和最小距離法評(píng)價(jià)4條序列的鑒定率，結(jié)果表明，rbcL鑒定率最高，其余依次是ITS 2、matK和psbA-trnH。詳見(jiàn)表5。

3　討　論

3.1　序列篩選

DNA條形碼是利用基因組中一條公認(rèn)的、標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子鑒定技術(shù)。線粒體基因組進(jìn)化最慢，對(duì)植物分辨率較低，適合動(dòng)物分子鑒定，不適合植物分子鑒定。相對(duì)于線粒體基因，葉綠體基因進(jìn)化相對(duì)較快，適合植物分子鑒定。核基因組進(jìn)化最快，也適合植物分子鑒定，所以葉綠體基因組和核基因組常用于植物分子鑒定。但葉綠體基因組和核基因組不同序列對(duì)各個(gè)植物類群又有差異。因此尋找適合各科屬植物鑒定的DNA條形碼成為現(xiàn)階段研究的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇目前認(rèn)為在各個(gè)科屬通用性較好的條形碼來(lái)考察黨參屬及其近緣屬的分子鑒定方法。ITS 2為核基因組，是rDNA上位于5.8 S和26 S之間的一段進(jìn)化速度很快的非編碼區(qū)，物種間變異位點(diǎn)較多，長(zhǎng)度很短，具有較高的擴(kuò)增效率和物種鑒定效率。matK、rbcL和psbA-trnH位于葉綠體基因組，由于其進(jìn)化速率較快，并且有較多的變異位點(diǎn)，常用于植物的分子鑒定，但3條序列側(cè)重點(diǎn)不同，rbcL適合分類階元較高的類類群，matK和psbA-trnH則恰好相反?？紤]到實(shí)驗(yàn)材料涉及到不同屬，所以選擇了3條葉綠體基因作為黨參屬金錢豹的分子鑒定。

3.2　PCR擴(kuò)增及測(cè)序率

PCR擴(kuò)增及測(cè)序率是進(jìn)行后續(xù)分類鑒定的前提。本實(shí)驗(yàn)中，4條序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序率較高，基本達(dá)100%，說(shuō)明所選序列在黨參屬和金錢豹屬植物中擴(kuò)增及測(cè)序較好，這為后面的序列分析提供了可能。

表5對(duì)比法和最小距離法分析4條候選序列的鑒定效率

序列鑒定方法樣品數(shù)鑒定成功率rbcL對(duì)比法4397．9最小距離法43100．0matK對(duì)比法5389．7最小距離法5387．9ITS2對(duì)比法5182．1最小距離法51100．0psbA?trnH對(duì)比法5382．8最小距離法5360．3

3.3　種間、種內(nèi)變異及Barcoding gap評(píng)估

一條好的DNA條形碼應(yīng)具有足夠高的種間多樣性，用于區(qū)分不同物種。種間變異、θ’及最小種間距離用于測(cè)定種間差異[12-13]。分析結(jié)果表明，ITS 2種間變異最大，顯示出其種間最高的多樣性，其次是matK，最小的是rbcL。種內(nèi)變異、θ及最大種內(nèi)距離用于種內(nèi)差異，matK種內(nèi)變異最大，psbA-trnH種內(nèi)變異最小。

理想的DNA條形碼是遺傳變異種間和種內(nèi)變異明顯分開，不存在重疊現(xiàn)象。根據(jù)Barcoding gap圖，4條DNA序列重疊率均較大，不能將黨參屬及金錢豹屬植物分開。Meyer等[12]和Moritz等[14]用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了密切相關(guān)的種增加時(shí)種內(nèi)和種間的遺傳變異交叉重疊現(xiàn)象會(huì)增加，本實(shí)驗(yàn)可能是由于黨參屬與金錢豹屬植物比較近緣，并且每個(gè)種數(shù)量較多，因此導(dǎo)致其無(wú)明顯的gap區(qū)。

3.4　鑒定率評(píng)估

DNA條形碼物種鑒定方法目前主要有對(duì)比法(BLAST 1)、最小距離法(Nearest distance)和建樹法(Tree-based method)。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)比法、最小距離法用于評(píng)價(jià)各條序列的鑒定成功率，主要是為了更好地考察各條序列的鑒定能力。對(duì)比法[15]是基于相似度的方法將鑒定DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)DNA序列進(jìn)行兩兩局部比對(duì)或搜索短的核苷酸字符串來(lái)查找數(shù)據(jù)庫(kù)中與之最相似的DNA序列。4條DNA序列對(duì)比法鑒定結(jié)果顯示，rbcL鑒定率最高，其次是matK，最低的是psbA-trnH。最小距離法[15]是將鑒定DNA序列與參考DNA序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，當(dāng)參考DNA序列與鑒定DNA序列有最小的兩兩比對(duì)距離時(shí)，則可進(jìn)行距離判定。4條序列最小距離法鑒定顯示，rbcL和ITS 2鑒定率最高，達(dá)到100%，psbA-trnH最低，僅60.3%。使用2種鑒定方法來(lái)評(píng)價(jià)4條序列的鑒定能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rbcL和ITS 2使用最小距離法鑒定效果較好，rbcL和matK使用對(duì)比法較佳。綜上所述，rbcL和ITS 2可用于黨參屬及其近緣屬的分子鑒定，matK可作為候選條形碼序列。

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