程吉云，岳 明，王 濤，周文靖，許 龍

(佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.),俗稱蟑螂、偷油婆、灶螞子等，其蟲體內(nèi)含有極豐富的營養(yǎng)和功能性成分，包括蛋白質(zhì)、維生素、幾丁質(zhì)等?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，黃酮類物質(zhì)在醫(yī)學上具有許多作用，如抗癌、增強免疫能力、保護心腦血管等，黃酮類物質(zhì)成為天然活性成分研究的重點對象之一[1]。研究資料表明，植物體內(nèi)含有豐富的黃酮類物質(zhì)，但是動物體內(nèi)含量相對較少，尤其是昆蟲體內(nèi)研究的較少。為研究如何從昆蟲體內(nèi)最大劑量地提取活性最大的黃酮物質(zhì)，筆者以美洲大蠊為研究對象，通過分析不同提取溫度、不同提取時間和不同料液比對美洲大蠊體內(nèi)黃酮提取率的影響，參考相關(guān)文獻[2-8]，確定最佳提取條件，期望為美洲大蠊的相關(guān)研究提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。該試驗所使用的美洲大蠊來自于河北省國中藥材市場，經(jīng)羅志文副教授鑒定為美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)隸屬于蜚蠊目(Blattaria)鱉蠊科(Corydidae)，該藥材及樣品被保存在佳木斯大學的應用昆蟲研究所。

1.1.2主要儀器與試劑。TU-1800/800S型紫外線可見分光光度計；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵； HHW-21CU-600電熱恒溫水槽及電熱鼓風干燥箱；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(索氏抽提器)；蘆丁標準品；石油醚；甲醇；正丁醇等。

1.2方法

1.2.1原料處理。美洲大蠊分揀較嚴格，要求不含雜質(zhì)。將分揀好的美洲大蠊置于冰箱速凍后使用電熱鼓風箱進行干燥處理(溫度設定為55～60 ℃)。將干燥的美洲大蠊粉碎過60～80目，然后使用石油醚對美洲大蠊粉末進行脫脂處理。

1.2.2黃酮液的提取。準確稱取美洲大蠊粉制品3.33 g置于抽提器中，并在其中加入石油醚3.34 mL。將抽提器置于70 ℃恒溫水浴鍋中，提取脂肪，濾除濾渣。在室溫環(huán)境下使用100 mL 濃度為50%的甲醇將其浸泡36 h，每3 h對其搖動1次，繼續(xù)抽濾，使用提取溶劑反復對濾渣進行洗滌3次。最后將濾液合并，舍棄濾渣，待濾液中的甲醇揮發(fā)后定容于100 mL的容量瓶中。

1.2.3黃酮含量的測定。標準曲線的制定：精確稱取蘆丁標準品10 mg，用50%甲醇轉(zhuǎn)溶于50 mL容量瓶，并定容至刻度，得0.20 mg/mL標準溶液。分別精確吸取0、1、2、3、4、5 mL上述溶液置于10 mL容量瓶內(nèi)，分別加入0.3 mL 5%等體積亞硝酸鈉溶液，振蕩搖勻后靜置5 min，分別加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后再靜置5 min，再加入4%氫氧化鈉4.0 mL，最后用50%甲醇稀釋定容，靜置30 min，用紫外可見分光光度計測定波長496 nm的吸光度值。采用DSP數(shù)據(jù)處理軟件處理，得到工作曲線回歸方程：A=0.011 6C+0.013 7(C為濃度，μg/mL；A為吸光值；相關(guān)系數(shù)R=0.995)，見圖1。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

采用移液管吸取上述樣品提取液0.1 mL滴入10 mL的容量瓶內(nèi)，再向該容量瓶中加入5%亞硝酸溶液各0.3 mL，輕輕振蕩容量瓶保證溶液均勻后靜置5 min。再加入濃度為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，同樣輕輕振蕩容量瓶后靜置5 min。再加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，輕輕振蕩后采用濃度為50%的甲醇分別稀釋后定容，輕輕晃動搖勻后靜置30 min。用紫外分光光度計測定該溶液在波長496 nm波長下的吸光度值A，使用相應的公式計算黃酮含量。

1.2.4不同因素提取試驗。使用不同的溫度、時間、料液比分別對脫脂后的美洲大蠊粉末中的黃酮物質(zhì)進行提取，測定所提取黃酮的含量，并將其換算為100 g干黃酮的提取率。

2　結(jié)果與分析

2.1提取溫度對黃酮提取率的影響由圖2可知，提取溫度在美洲大蠊黃酮的提取過程中扮演著十分重要的角色。該試驗過程所使用的酒精濃度為90%，提取時間固定為8 h，分別使用不同料液比[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)]對美洲大蠊中黃酮的成分進行提取。提取溫度設定在25～65 ℃，可以看出隨著溫度的提升，美洲大蠊的黃酮提取率逐漸增高。雖然溫度對黃酮提取率有影響，但是黃酮提取率所受影響程度不太大，并且5種不同料液比條件下，黃酮提取率受溫度影響程度比較一致。綜合考慮溶解度和能耗等因素，最后確定美洲大蠊黃酮提取溫度確定為25 ℃。

圖2　提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2提取時間對黃酮提取率的影響圖3顯示的是提取溫度為25 ℃，料液比為1∶4(g/mL)的條件下，使用濃度不同的乙醇對黃酮進行提取，黃酮提取率隨提取時間的變化過程?？梢钥闯觯崛r間對美洲大蠊黃酮類化合物的提取率具有明顯的影響。隨著提取時間的推進，乙醇不斷溶解更多的黃酮類化合物。當乙醇濃度在55%～65%時，當提取時間超過12 h之后，黃酮類化合物的提取率變化比較緩慢；當乙醇濃度為75%～90%時，在提取時間為4～12 h范圍內(nèi)，隨著提取時間的增加，黃酮提取率顯著增加，但超過24 h后，黃酮提取率變化不明顯。因此得出，美洲大蠊黃酮最佳提取時間為12 h。

圖3　提取時間對黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of flavone

2.3料液比對黃酮提取率的影響提取液的配比對黃酮提取率也會產(chǎn)生明顯的影響。圖4顯示的是乙醇濃度為90%、提取溫度為25 ℃條件下，不同料液比提取黃酮的試驗過程，提取時間分別為8、12、 24、 48 h?？梢钥闯鎏崛r間的增加會在一定程度上提升黃酮類化合物的提取率；并且隨著料液比的增多，美洲大蠊黃酮類化合物的提取率也在逐漸提升。同時也可以看出，隨著提取時間的增加，料液比為1∶4～1∶8(g/mL)，美洲大蠊黃酮提取率的變化最為明顯；當料液比超過1∶8(g/mL)時，美洲大蠊黃酮提取率的變化逐漸趨于平穩(wěn)。

圖4　料液比對黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

隨著料液比的提升，提取時間為8 h條件下，提取的美洲大蠊黃酮含量變化較大，隨著提取時間的增加，其提取率變化不明顯。

由圖4可以看出，12～48 h階段，美洲大蠊黃酮類提取率的變化趨勢比較接近，且變化幅度不大；縱向分析圖4可以看出，料液比為1∶8～1∶12(g/mL)，黃酮類化合物的提取率變化緩慢，增幅較小。因此，綜合考慮各種因素最終確定美洲大蠊黃酮最佳提取料液比為1∶8～1∶12(g/mL)。為了節(jié)省成本，可將料液比縮小至1∶8(g/mL)。

3　結(jié)論與討論

美洲大蠊含有的黃酮類化合物比較豐富，每100 g含量在1 600.0～1 970.0 mg，因此對美洲大蠊黃酮類化合物的提取工藝進行研究具有十分積極的意義。

通過對不同提取溫度、不同提取時間和不同料液比的黃酮提取效果進行對比分析，綜合考慮各種因素，最終確定美洲大蠊黃酮類化合物最佳提取條件為提取溫度為25 ℃，提取時間為12 h，料液比為1∶8(g/mL)。

[1] 張來，楊碧昌，劉寧.植物黃酮類化合物在醫(yī)藥上的應用[J].安順學院學報，2010，12(2)：84-88.

[2] 劉重芳, 吳志榮, 方青漢.銀杏葉總黃酮提取工藝探討[J].中成藥, 1992,14(7):7-8.

[3] 侯學敏, 李林霞, 張直峰,等.響應面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學, 2013, 34(6):124-128.

[4] 莫開菊, 程超, 黃鵬,等.生姜黃酮提取純化及結(jié)構(gòu)的初步鑒定[J].食品科學, 2005, 26(9):229-233.

[5] 歐陽平, 張高勇, 康保安.類黃酮提取的基本原理、影響因素和傳統(tǒng)方法[J].中國食品添加劑, 2003(5):54-57.

[6] 王軍, 王敏, 于智峰,等.基于響應曲面法的苦蕎麩皮總黃酮提取工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)機械學報, 2007, 38(7):205-208.

[7] 孫哲浩, 李寶珍, 趙謀明,等.響應面分析法優(yōu)化荔枝核總黃酮提取工藝的研究[J].食品與機械, 2006, 22(1):30-32.

[8] 任鳳蓮, 谷芳芳, 吳梅林,等.利用響應面分析法優(yōu)化山楂中總黃酮提取條件[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(1):126-129.