盧其騰 曲頌 李齡 韋靜妮 劉志杰 余彬彬 周磊 陳凱華 林國享 孫永楚 朱小東，5

放射可引起鼻咽癌細(xì)胞DNA損傷，包括雙鏈和單鏈DNA斷裂，造成細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡等，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。但在放療過程中，放射會(huì)激活DNA修復(fù)系統(tǒng)，降低放射敏感性，導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生放射抗拒，引起局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［1］。有研究提示PARP-1除具有DNA損傷識(shí)別和修復(fù)中的直接作用外，還可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子功能，包括p53和NF-κB等［2］；在某些癌癥背景下，PARP-1與轉(zhuǎn)錄因子HIF1［3］和Snail1［4］相互作用，可能與細(xì)胞遷移、侵襲有關(guān)。本研究通過慢病毒沉默鼻咽癌CNE-2細(xì)胞PARP-1基因，照射后觀察CNE-2細(xì)胞的遷移和侵襲情況，以探討PARP-1對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與材料

人鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌CNE-2細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所與廣東醫(yī)學(xué)院建株，購于上海復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。針對(duì)PARP-1基因（Gene ID：142；NM_001618.3）的慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建，病毒轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后由本課題組傳代、凍存；兔抗人多克隆抗體波形蛋白（Vimentin）購于沈陽萬類生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗體PARP-1購于美國CST公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自碧云天公司；Precise LINAC直線加速器購于瑞典Elekta公司；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；基質(zhì)膠及Tanswell小室購于美國Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

從-80℃冰箱取出凍存的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞、轉(zhuǎn)染陰性病毒對(duì)照細(xì)胞和轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默PARP-1基因細(xì)胞，復(fù)蘇、傳代，加入10%牛胎血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究將CNE-2細(xì)胞分為空白對(duì)照組（CNE-2組）、轉(zhuǎn)染陰性病毒對(duì)照組（NC組）、轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默PARP-1基因組（LV組）和未照射組（CNE-2-0 Gy組）。

1.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞遷移情況

細(xì)胞用胰酶消化，收集狀態(tài)良好的細(xì)胞，離心后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/mL，以2 mL/孔均勻加入6孔板中培養(yǎng)24 h，用200μL槍頭以45°在孔板上劃痕，PBS輕洗脫落細(xì)胞3遍，換成1640培養(yǎng)基，給予10 Gy劑量照射（源皮距100 cm，采用等效膜覆于孔板蓋），于0 h、48 h在顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件測(cè)量、計(jì)算細(xì)胞遷移率，計(jì)算公式：細(xì)胞遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞遷移和侵襲情況

將細(xì)胞撤血清培養(yǎng)24 h，于24孔板中加入500μL 10%牛胎血清的1640培養(yǎng)基，把小室置入24孔板。遷移實(shí)驗(yàn)為上室加入100μL細(xì)胞濃度為1x105/mL的懸液，給予10Gy劑量照射，培養(yǎng)48 h。侵襲實(shí)驗(yàn)則予上室加入100μL按1∶5稀釋的基質(zhì)膠并放回培養(yǎng)箱1 h，待基質(zhì)膠凝固，再加入100μL細(xì)胞濃度為5×105/mL的懸液，給予10 Gy劑量照射（源皮距100 cm，采用等效膜覆于孔板蓋），培養(yǎng)48 h。棉簽把上室細(xì)胞清除，穿入下室的細(xì)胞以4%多聚甲醛固定30min、吉姆薩染液染色45min，顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞PARP-1和Vimentin蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期貼壁融合度約為80%的細(xì)胞，撤血清24 h，蓋上等效膜，給予10Gy劑量照射，48 h后提取各組PARP-1和Vimentin總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后于100℃下變性5 min；分別于10%、8%的SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，100mA恒流轉(zhuǎn)膜120min，5%脫脂乳粉封閉120min，分別加入1∶1000稀釋的一抗中4℃孵育過夜，TBST漂洗后室溫孵育于1∶1 000稀釋的二抗60 min，采用凝膠成像分析儀掃描，使用Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞遷移情況

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，照射后48 h CNE-2組、NC組、LV組和CNE-2-0 Gy組的細(xì)胞遷移率分別為（79.37±5.75）%、（70.13±6.56）%、（20.83±10.91）%和（27.13±7.50）%。LV組細(xì)胞遷移率較CNE-2組和NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LV組與CNE-2-0Gy組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 照射后48 h不同處理組CNE-2細(xì)胞遷移情況

2.2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲情況

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，照射后48 h CNE-2組、NC組、LV組和CNE-2-0 Gy組遷移穿入下室的細(xì)胞數(shù)分別為（60.00±2.66）個(gè)、（52.33±9.71）個(gè)、（13.67±3.51）個(gè)和（23.33±4.04）個(gè)；侵襲入下室細(xì)胞數(shù)分別為（33.00±2.00）個(gè)、（29.00±1.72）個(gè)、（6.67±2.52）個(gè)和（9.67±1.16）個(gè)。LV組遷移、侵襲入下室的細(xì)胞數(shù)分別比CNE-2組和NC組少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LV組與CNE-2-0 Gy組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 照射后48 h不同處理組CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲情況

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2細(xì)胞PARP-1和Vimentin蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，照射后48 h CNE-2組、NC組、LV組和CNE-2-0Gy組PARP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.02±0.04、0.47±0.05和0.47±0.06；Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.99±0.04、0.24±0.02和0.27±0.03。LV組PARP-1蛋白、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別較CNE-2組和NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LV組與CNE-2-0 Gy組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 照射后48 h不同處理組CNE-2細(xì)胞中PARP-1及Vim entin蛋白的表達(dá)

3 討論

放療是鼻咽癌有效的治療手段，隨著放療技術(shù)不斷進(jìn)步，大部分患者可取得較好療效。但仍有約20%的患者存在局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［5］。鼻咽癌放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及多基因、多層次調(diào)控，探索其中的分子機(jī)制對(duì)鼻咽癌治療及改善患者預(yù)后有重要的價(jià)值。目前已有研究證實(shí)射線會(huì)造成DNA分子損傷，激活DNA修復(fù)系統(tǒng)，如PARP家族。該家族由18個(gè)核蛋白組成［6-7］，其中PARP-1在堿基切除修復(fù)過程中具有核心修復(fù)功能，電離輻射所致的DNA單鏈損傷斷裂可誘導(dǎo)PARP-1大量活化。本課題組前期研究提示，電離輻射的計(jì)量及時(shí)間延長可使PARP-1下游產(chǎn)物表達(dá)增加，修復(fù)損傷的DNA分子，減少細(xì)胞死亡，致使放射敏感性降低，并誘導(dǎo)自噬，最終導(dǎo)致放射抗拒［8］，并可能進(jìn)一步分泌放射抗拒相關(guān)蛋白（如CD166）［9］，使病灶殘存，成為局部復(fù)發(fā)前提，亦可能分泌促淋巴管新生分子而促進(jìn)轉(zhuǎn)移［10］。Vimentin是一種中間絲蛋白，在多項(xiàng)研究中被證明是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子［11］，其上調(diào)可能是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）誘導(dǎo)的先決條件［12］。在乳腺上皮細(xì)胞中沉默Vimentin可導(dǎo)致EMT相關(guān)基因N-鈣黏蛋白、酪氨酸激酶Axl、整合素β4亞基及尿激酶型纖溶酶原激活因子表達(dá)下調(diào)［13］。此外，Vimentin還可被Akt1磷酸化，從而免受半胱天冬氨酸誘導(dǎo)的蛋白水解，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力［14］。在肺癌細(xì)胞中PARP-1基因緊挨Vimentin的啟動(dòng)子區(qū)域，可誘導(dǎo)差異性表達(dá)［15］，Vimentin高表達(dá)提示腫瘤細(xì)胞可獲得更強(qiáng)的遷移、侵襲能力［16］。

為探討鼻咽癌細(xì)胞中PARP-1與遷移、侵襲的關(guān)系，本研究在CNE-2細(xì)胞中沉默PARP-1基因，并給予10 Gy照射劑量，48 h后觀察劃痕愈合、Transwell小室遷移及侵襲、PARP-1及Vimentin蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)LV組的細(xì)胞遷移能力下降，細(xì)胞遷移率較CNE-2組和NC組低；LV組Transwell小室遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)穿入下室的細(xì)胞數(shù)亦較CNE-2組和NC組少，而LV組與未照射的CNE-2-0 Gy組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些生物行為學(xué)上的改變，提示PARP-1表達(dá)與鼻咽癌CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲能力可能存在正相關(guān)。同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LV組PARP-1及Vimentin蛋白表達(dá)與CNE-2組、NC組相比均下調(diào)，但LV組與未照射的CNE-2-0Gy組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。潛在的可能分子機(jī)制是PARP-1基因與Vimentin啟動(dòng)子位置緊挨，未照射的CNE-2-0Gy組PARP-1未被激活，而照射后的LV組PARP-1被干擾而表達(dá)相對(duì)下調(diào)，Vimentin的啟動(dòng)子未受其影響，未被激活，致使Vimentin表達(dá)相對(duì)下調(diào)［15］；降低EMT水平［12］，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移、侵襲。照射后的CNE-2組和NC組PARP-1被激活，Vimentin啟動(dòng)子受PARP-1影響亦被激活，Vimentin表達(dá)隨之上調(diào)，并進(jìn)一步正向調(diào)控EMT，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移、侵襲。

綜上所述，照射后PARP-1可被激活，且表達(dá)相對(duì)上調(diào)，從而促進(jìn)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞遷移、侵襲。PARP-1有望成為鼻咽癌放療后轉(zhuǎn)移新的治療靶點(diǎn)，但其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］ Qu C，Zhao Y，F(xiàn)eng G，et al.RPA3 is a potentialmarker of prognosis and radioresistance for nasopharyngeal carcinoma［J］.JCell Mol Med，2017，21（11）：2872-2883.

［2］ Wu SL，Li YJ，Liao K，et al.2-Methoxyestradiol inhibits the proliferation and migration and reduces the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 stem cells via NF-κB/HIF-1 signaling pathway inactivation and EMT reversal［J］.OncolRep，2017，37（2）：793-802.

［3］ Martin-Oliva D，Aguilar-Quesada R，O'valle F，et al.Inhibition of poly（ADP-ribose）polymerasemodulates tumor-related gene expression，including hypoxia-inducible factor-1 activation，during skin carcinogenesis［J］.Cancer Res，2006，66（11）：5744-5756.

［4］ Rodríguez MI，González-Flores A，Dantzer F，et al.Poly（ADP-ribose）-dependent regulation of Snail1 protein stability［J］.Oncogene，2011，30（42）：4365-4372.

［5］ Suárez C，Rodrigo JP，Rinaldo A，et al.Current treatment options for recurrentnasopharyngeal cancer［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2010，267（12）：1811-1824.

［6］ AméJC，Spenlehauer C，De Murcia G.The PARP superfamily［J］.Bioessays，2004，26（8）：882-893.

［7］ Schreiber V，Dantzer F，Ame JC，et al.Poly（ADP-ribose）：novel functions for an old molecule［J］.NatRev MolCell Biol，2006，7（7）：517-528.

［8］ Zhou ZR，Zhu XD，Zhao W，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase-1 regulates the mechanism of irradiation-induced CNE-2 human nasopharyngeal carcinoma cell autophagy and inhibition of autophagy contributes to the radiation sensitization of CNE-2 cells［J］.Oncol Rep，2013，29（6）：2498-2506.

［9］ 林歡，朱小東，陳澤曇，等.CD166對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放射敏感性的影響［J］.中國癌癥防治雜志，2017，9（1）：45-49.

［10］ 鄧戀，劉陶文，屈元姣，等.淋巴管密度與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.實(shí)用癌癥雜志，2014，29（9）：1097-1100.

［11］ Mendez MG，Kojima S，Goldman RD.Vimentin induces changes in cell shape，motility，and adhesion during the epithelial tomesenchymal transition［J］.FASEB J，2010，24（6）：1838-1851.

［12］ Ivaska J.Vimentin：central hub in EMT induction?［J］.Small GTPases，2011，2（1）：51-53.

［13］ Rodríguez MI，Peralta-Leal A，O'valle F，et al.PARP-1 regulates metastaticmelanoma throughmodulation of vimentin-induced malignant transformation［J］.PLoSGenet，2013，9（6）：e1003531.

［14］ Zhu QS，Rosenblatt K，Huang KL，et al.Vimentin is a novel AKT1 targetmediatingmotility and invasion［J］.Oncogene，2011，30（4）：457-470.

［15］ Rho JH，RoehrlMH，Wang JY.Glycoproteomic analysisof human lung adenocarcinomas using glycoarrays and tandem mass spectrometry：differential expression and glycosylation patterns of vimentin and fetuin a isoforms［J］.Protein J，2009，28（3-4）：148-160.

［16］ 李幼梅，張思儀，趙連梅，等.LIN28A、E-cadherin和vimentin在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.癌變·畸變·突變，2017，29（4）：304-308，312.