徐阿晶，　馬　婧，　黃曉會(huì)，　蔣興浩

(1. 上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科， 上海 200092;2. 上海交通大學(xué) 電子信息與電氣工程學(xué)院, 上海 200240)

0　引　言

秀麗線(xiàn)蟲(chóng),亦稱(chēng)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)，以細(xì)菌為食, 其生命周期約為3 d, 平均壽命為3周。成蟲(chóng)體長(zhǎng)約1.0～1.5 mm, 體表有一層角質(zhì)層覆蓋物。作為一種模式動(dòng)物, 已廣泛應(yīng)用于當(dāng)前生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

秀麗線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)各種生物、化學(xué)刺激物會(huì)產(chǎn)生趨化作用，通過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)各種刺激物的反應(yīng)特性加以鑒別可以實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)。早先的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)生物檢測(cè)研究方法是先使用疊氮化鈉將培養(yǎng)基上的線(xiàn)蟲(chóng)麻痹使之少動(dòng)或者不動(dòng)，然后再對(duì)刺激物所在的培養(yǎng)基材料各個(gè)區(qū)域中線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，以判斷線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)不同刺激物產(chǎn)生的趨化作用。但這種方法有很多重復(fù)性的人工操作，需要肉眼通過(guò)顯微鏡觀(guān)察判斷線(xiàn)蟲(chóng)是否死亡，耗費(fèi)很多人力和時(shí)間。近年來(lái),國(guó)外學(xué)者提出了對(duì)整個(gè)生物活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行測(cè)定，特別是秀麗線(xiàn)蟲(chóng)在培養(yǎng)基上活動(dòng)的詳細(xì)運(yùn)動(dòng)軌跡，例如通過(guò)顯微鏡記錄蟲(chóng)體蠕動(dòng)速度和蟲(chóng)體扭轉(zhuǎn)頻率等參數(shù)[1-2]。Moy等隨后對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了更加微型化和全自動(dòng)化的高通量篩選系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由復(fù)雜對(duì)象分類(lèi)篩選系統(tǒng)COPAS和自動(dòng)圖像獲取處理系統(tǒng)Biosort。使用這個(gè)系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)微型化和全自動(dòng)化的384孔板采集分析的高通量篩選[3]。但此系統(tǒng)價(jià)格昂貴，而且上述方法受限于攝像顯微鏡的數(shù)量和視野，通常只能用384孔板的微量培養(yǎng)基做短時(shí)間觀(guān)察，而難以使用其他培養(yǎng)皿進(jìn)行不同分組之間的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的大面積、長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察。

為此，本文采用一種可用于6孔板的多重可視化指標(biāo)的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)藥物篩選評(píng)估體系，最多可以使用六個(gè)高清攝像頭同時(shí)記錄6孔板上線(xiàn)蟲(chóng)活動(dòng)的軌跡，并用自定義Matlab腳本處理圖像。

1　材料與方法

(1) 線(xiàn)蟲(chóng)與菌株。N2 野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(C. elegans， Bristolstrain N2)和大腸桿菌E.coliOP50，銅綠假單孢菌PseudomonasAeruginosa(PA14)由中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所楊崇林研究員惠贈(zèng)。

(2) 試劑。疊氮鈉、蛋白胨、瓊脂粉、藥物等來(lái)自 Sgima公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

(3) NGM 培養(yǎng)基。1 L的NGM培養(yǎng)基含17 g瓊脂， 2. 5 g蛋白胨， 3 g NaCl， 1 mol/LPBS液(pH6.0) 25 mL，入975 mL蒸餾水，滅菌后加入濾膜除菌的1 mL膽固醇溶液( 5 mg/mL乙醇) ， 1 mol/L CaCl21 mL， 1 mol/L MgSO41 mL。

(4) M9緩沖液。1 L的M9緩沖液含15.12 g Na2HPO4·12H2O， 5 g NaCl， 3 g KH2PO4， 0.25 g MgSO4·7H2O。

2　線(xiàn)蟲(chóng)自主活動(dòng)跟蹤記錄系統(tǒng)

2.1　機(jī)械組件

為了記錄、觀(guān)察線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)，自制了一個(gè)攝影燈箱，使用不銹鋼板焊接成型，頂部開(kāi)有6個(gè)直徑32 mm的觀(guān)察孔，在觀(guān)察孔上使用熱熔膠固定了6根PVC管，以利于安裝攝像頭。該觀(guān)察記錄裝置由圖1所示的304不銹鋼板焊接、裝配制成，分為上下兩層，下層為電源、散熱風(fēng)扇，為箱體光源提供穩(wěn)定的低紋波直流電源。上層主要由光源、攝像頭和6孔培養(yǎng)板組成。上層結(jié)構(gòu)的正中放置6孔培養(yǎng)板，6孔板內(nèi)含有培養(yǎng)基和秀麗線(xiàn)蟲(chóng)。6孔板側(cè)壁四周?chē)@一排發(fā)光二極管燈帶，燈帶背面的膠水緊貼不銹鋼外殼對(duì)外散熱，6孔板底部也放置有一塊平面光源。由于發(fā)光二極管燈帶為散射光源，部分光線(xiàn)會(huì)散射到6孔板上方造成損失，因此在燈帶上方放置了一塊中空不銹鋼遮光板，中空部分稍大于6孔板的外緣，該中空板可以將散射的光線(xiàn)重新聚集到6孔板的側(cè)壁，引導(dǎo)光線(xiàn)從側(cè)面射入6孔板。

圖1觀(guān)察記錄裝置的結(jié)構(gòu)示意圖

1-觀(guān)察箱體; 2-攝像頭; 3-中空遮光板; 4-側(cè)壁發(fā)光二極管燈帶; 5-6孔培養(yǎng)板; 6-電源控制模塊; 7-散熱風(fēng)扇; 8-底部平面光源

在觀(guān)察箱的頂部，用不銹鋼開(kāi)孔器開(kāi)6個(gè)直徑φ32 mm孔，開(kāi)孔距離與6孔板的孔距完全一致，取φ(32×1) mm的PVC電工管，截取12 cm左右插入開(kāi)孔處，用熱熔膠槍初步固定PVC管。購(gòu)買(mǎi)微軟LifeCam Cinema HD 高清攝像頭，拆除外固定裝置后將攝像頭插入PVC管中。由于該攝像頭具有自動(dòng)對(duì)焦和錄音功能，因此其麥克風(fēng)部分有一定突起，正好卡住PVC管壁固定，緩慢調(diào)節(jié)攝像頭、PVC管高度，使其視野完全覆蓋6孔板，此時(shí)6孔板培養(yǎng)基距離攝像頭約5 cm，攝像頭自動(dòng)對(duì)焦后即可成像并開(kāi)始記錄，最后用熱熔膠槍將PVC管和攝像頭固定完全。

2.2　秀麗線(xiàn)蟲(chóng)觀(guān)測(cè)條件

秀麗線(xiàn)蟲(chóng)成蟲(chóng)的大小約1 mm，蟲(chóng)體為白色半透明狀，因此使用傳統(tǒng)倒置顯微鏡觀(guān)察96孔板時(shí)主要通過(guò)透射光的折光率差異成像，由于顯微鏡視野過(guò)小，只能觀(guān)察幼蟲(chóng)，而使用攝像頭觀(guān)察32 mm直徑的大視野6孔板時(shí)，透射光的觀(guān)測(cè)效果非常差，因此光源部分采用了暗視野技術(shù)，在6孔板下方安裝黑色的遮光紙，在箱體側(cè)面安裝LED燈帶，LED燈帶的散熱面緊貼箱體，通過(guò)箱體散熱。

2.3　數(shù)據(jù)采集與分析

線(xiàn)蟲(chóng)被培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板(U型)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤霚y(cè)試物，然后放入攝影燈箱，開(kāi)啟光源和攝像頭，使用計(jì)算機(jī)錄制線(xiàn)蟲(chóng)的的自發(fā)活動(dòng)視頻，通常記錄24 h或更長(zhǎng)時(shí)間，并記錄活動(dòng)情況。

使用2個(gè)計(jì)算機(jī)程序分別用于記錄和分析視頻，記錄軟件選用Debut Video Capture Software Professional,分析軟件采用自主編寫(xiě)的LabVIEW以及MatLab腳本進(jìn)行視頻分析，提取線(xiàn)蟲(chóng)的活動(dòng)記錄信息。

2.4　實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.4.1培養(yǎng)條件

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)菌感染方法。從成蟲(chóng)分離蟲(chóng)卵，在M9緩沖液中孵化過(guò)夜，得到L1 期幼蟲(chóng)，將幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基的E.coli菌苔上在20 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長(zhǎng)48 h，用M9緩沖液洗脫蟲(chóng)體并反復(fù)清洗后，將蟲(chóng)體分別轉(zhuǎn)移到普通瓊脂平板的銅綠假單胞菌的菌苔上，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h進(jìn)行感染，感染后轉(zhuǎn)移到6孔板的M9緩沖液中 (緩沖液中加入25 mol/L 5-氟脫氧尿苷(5-FUDR)，以防止自我繁殖) 繼續(xù)培養(yǎng)，觀(guān)察記錄每日死亡情況。培養(yǎng)板邊緣用膠帶密封，以防止干燥，系統(tǒng)可記錄線(xiàn)蟲(chóng)自發(fā)活動(dòng)超過(guò)21 d。

2.4.2視頻記錄裝置的環(huán)境控制

由于線(xiàn)蟲(chóng)合適的生存溫度為12～22 ℃，最佳培養(yǎng)溫度為18 ℃，視頻跟蹤記錄裝置的溫度控制顯得尤為重要。上述裝置的電源部分帶有散熱風(fēng)扇，適當(dāng)措施后實(shí)測(cè)觀(guān)察箱內(nèi)溫度(17±2) ℃，達(dá)到線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)的理想溫度。 6孔板的外面在記錄前應(yīng)噴涂防霧液并干燥成膜，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)凝結(jié)造成視頻圖像模糊。

3　結(jié)　果

3.1　線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)軌跡的觀(guān)察

微軟攝像頭自帶的記錄軟件能夠以30幀/s的速率記錄高清運(yùn)動(dòng)圖像，因此選用了自帶核心顯卡的Intel i5-2400處理器的筆記本電腦作為記錄硬件。線(xiàn)蟲(chóng)在培養(yǎng)基中的移動(dòng)速度是緩慢的，而且考慮到USB總線(xiàn)的帶寬以及CPU視頻壓縮能力，記錄線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)軌跡并不需要那么高的幀率，特別是以30幀/s默認(rèn)幀率存儲(chǔ)的視頻文件體積較為龐大，因此我們使用了錄像軟件Debut Video Capture Software Professional進(jìn)行記錄。選擇合適的分辨率960×720， Change Frame Rate設(shè)置為5幀/s。圖2顯示的是本觀(guān)察箱采集線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)軌跡原始錄像截圖。其中存活的線(xiàn)蟲(chóng)與死亡的線(xiàn)蟲(chóng)在形態(tài)方面有明顯差異，存活的線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)多為S型游動(dòng)的正弦狀態(tài)，死亡的線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)多為直線(xiàn)型僵直狀態(tài)(見(jiàn)圖 2)。

(a) 存活的線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)形態(tài)截圖

(b) 死亡的線(xiàn)蟲(chóng)

3.2　視頻分析用軟件

采用自主編寫(xiě)的LabVIEW以及MatLab軟件進(jìn)行，提取線(xiàn)蟲(chóng)的活動(dòng)記錄信息。自動(dòng)分析計(jì)算線(xiàn)蟲(chóng)的成活率，及組間的差別(見(jiàn)圖3)。

圖3　軟件自動(dòng)分析計(jì)算線(xiàn)蟲(chóng)的成活率

3.3　銅綠假單胞菌感染對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)生存的影響及藥物的治療效果

圖4　　　　美羅培南對(duì)銅綠假單胞菌感染引起的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)死亡具有保護(hù)作用

從圖4可以看到，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)被銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosa，PA14)感染1d后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死亡，隨后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，多次實(shí)驗(yàn)表明，被銅綠假單胞菌感染后的線(xiàn)蟲(chóng)均在7d內(nèi)死亡。我們的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與OP-50菌處理的線(xiàn)蟲(chóng)相比，銅綠假單胞菌感染線(xiàn)蟲(chóng)的生存期限明顯縮短(見(jiàn)圖4)。而美羅培南(100 μg/mL)治療，可以明顯改善銅綠假單胞菌感染的線(xiàn)蟲(chóng)的生存時(shí)間和生存率。

4　討　論

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)是近20年新興的模式動(dòng)物，與傳統(tǒng)模式動(dòng)物相比，秀麗線(xiàn)蟲(chóng)全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，遺傳背景非常清楚；線(xiàn)蟲(chóng)生命周期短(從蟲(chóng)卵發(fā)育到成蟲(chóng)只需要53 h)，通過(guò)直接注射外源DNA的方法在很短時(shí)間內(nèi)就可以獲得轉(zhuǎn)基因線(xiàn)蟲(chóng)；而且通過(guò)簡(jiǎn)單的喂食方法進(jìn)行RNAi就能敲除基因。而且，秀麗線(xiàn)蟲(chóng)可以像培養(yǎng)細(xì)胞一樣儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱或液氮中，這就為大量保存和使用各種遺傳背景的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)株系提供了極大的便利。這些特點(diǎn)使得秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)菌感染模型存在著基因操作簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確度高、費(fèi)用低廉，特別適合用于大規(guī)模藥物篩選等許多優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)已較多地被用于抗菌藥物篩選，以及對(duì)特定病原菌毒力基因/毒力因子/與宿主相互作用/及致病機(jī)制方面的研究[4-9]。

近2年來(lái)，以CRISPR/Cas9為代表的最新的基因組編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的基因組靶向改造，成為后基因組時(shí)代的功能基因組研究、疾病模型建立以及基因治療等不同領(lǐng)域研究與應(yīng)用的利器[10-15]。由于秀麗線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物本身具有的各種特性，比如遺傳背景清晰、基因操作簡(jiǎn)單快速、可在顯微鏡下直接進(jìn)行基因的表型分析及表達(dá)部位分析，生命周期短，很容易凍存和復(fù)蘇轉(zhuǎn)基因線(xiàn)蟲(chóng)及突變線(xiàn)蟲(chóng)等等[4-9]，所以CRISPR技術(shù)在秀麗線(xiàn)蟲(chóng)上的應(yīng)用可謂強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，具有強(qiáng)大的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景[9-15]。

而另一方面，使用秀麗線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選，卻始終存在人力耗費(fèi)大的缺點(diǎn)，如果使用全進(jìn)口的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)自動(dòng)計(jì)數(shù)和分選系統(tǒng)，價(jià)格非常昂貴，本課題組試制觀(guān)察箱光源從側(cè)面射入，關(guān)閉底部背景光源并用黑紙墊于6孔板下方，制作黑色背景的時(shí)候線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)比度可以大幅提升，觀(guān)察箱光源選用12 V直流供電的LED燈帶，排除頻閃干擾；燈箱內(nèi)壁噴黑漆，減少箱內(nèi)雜散光散射；φ(32×1) mm的PVC管、攝像頭的正面部分涂黑漆，避免攝像頭、PVC管倒映在培養(yǎng)基的表面上形成鏡像干擾。攝像頭選用帶有自動(dòng)對(duì)焦功能的光學(xué)玻璃鏡攝像頭，獲得最佳觀(guān)測(cè)效果。使用攝像頭錄像軟件Debut Video Capture Software Professional進(jìn)行記錄，以5幀/s默認(rèn)幀率記錄存儲(chǔ)。

現(xiàn)有的線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)技術(shù)主要以L(fǎng)B培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，6孔板由于線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目多，對(duì)培養(yǎng)基的透明度要求高，難于實(shí)時(shí)觀(guān)察計(jì)數(shù)。本研究在半透明培養(yǎng)基配制時(shí)適當(dāng)更改配方，減少半透明物質(zhì)如蛋白胨的用量，并過(guò)濾除去雜質(zhì)。經(jīng)上述多項(xiàng)參數(shù)優(yōu)化措施，可實(shí)現(xiàn)對(duì)6孔板中線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行清晰、連續(xù)地采集記錄。并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)時(shí)間、大范圍運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)化統(tǒng)計(jì)分析。

本研究組基于Matlab編寫(xiě)的圖像處理程序，主要用于提取線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)活躍程度的數(shù)據(jù)，包括存活與否的判斷、蟲(chóng)體扭動(dòng)頻率，蟲(chóng)體累計(jì)移動(dòng)路程，以及線(xiàn)蟲(chóng)存活率的自動(dòng)統(tǒng)計(jì)。本文通過(guò)對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)行為模式的視頻內(nèi)容進(jìn)行采集、記錄、智能理解與統(tǒng)計(jì)分析，建立病原菌/藥物/生物體三位一體的多重視頻指標(biāo)的耐藥菌敏感的藥物篩選評(píng)估研究體系。

5　結(jié)　語(yǔ)

本研究建立的秀麗線(xiàn)蟲(chóng)抗菌藥物篩選評(píng)估研究體系，可應(yīng)用于抗菌藥物的快速簡(jiǎn)便篩選，及相應(yīng)的作用機(jī)制研究，具有較好的前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]Bendesky A, Tsunozaki M, Rockman M V,etal. Catecholamine receptor polymorphisms affect decision-making in C. elegans.[J] Nature, 2011, 472: 313-318.

[2]Buckingham S D, Sattelle D B. Strategies for automated analysis of C. elegans locomotion. Invertebrate[J]. Neuroscience, 2008, 8:121-131.

[3]Moy T I, ConeryA L, Larkins-Foed,etal. High throughput screen for novel antimicrobialsusingawhile animal infection model[J]. ACS ChemBiol, 2009, 4(7):527-533.

[4]Couillault C, Ewbank J J. Diverse bacteria are pathogens of Caenorhabditiselegans[J]. Infect Immun，2002，70(8):4705-4707.

[5]Paulander W，Pennhag A，Andersson D I，etal.Caenorhabditiselegans as a model to determine fitness of antibioticaresistant Salmonella entericaserovar typhimurium[J]. Antimicrob Agents Chemother，2007，51(2):766-769.

[6]Vaitkevicius K，Lindmark B，Ou G，etal. A Vibrio cholerae protease needed for killing of Caenorhabditiselegans has a role in protection from natural predator grazing[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(24):9280-9285.

[7]Lee D G，Urbach J M，Wu G，etal. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial[J]. Genome Biol，2006，7(10):R90.

[8]Jansen W T，Bolm M，Balling R，etal.Hydrogen peroxide?mediated killing of Caenorhabditiselegans by treptococcuspyogenes[J]. Infect Immun，2002，70(9):5202-5207.

[9]Xu A, Shi G, Liu F,etal. Caenorhabditis elegans mom-4 is required for the activation of the p38 MAPK signaling pathway in the response to Pseudomonas aeruginosa infection[J]. Protein Cell, 2013, 4:53-61.

[10]Paix A, Folkmann A, Seydoux G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans[J]. Methods, 2017, S1046-2023(16):30285-30287.

[11]Iwata S, Yoshina S, Suehiro Y,etal.Engineering new balancer chromosomes in C. elegans via CRISPR/Cas9[J]. Sci Rep, 2016, 6:33840.

[12]Paix A, Schmidt H, Seydoux G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs[J]. Nucleic Acids Res, 2016, 44(15):e128.

[13]Li W, Ou G. The application of somatic CRISPR-Cas9 to conditional genome editing in Caenorhabditis elegans[J]. Genesis, 2016, 54(4):170-181.

[14]Dickinson DJ, Goldstein B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering[J]. Genetics, 2016, 202(3):885-901.

[15]Xu S, Wang Z, Kim K W,etal. Chisholm AD.Targeted Mutagenesis of Duplicated Genes in Caenorhabditis elegans Using CRISPR-Cas9[J]. J Genet Genomics, 2016, 43(2):103-106.