李海全，萬青山，王 雪，王 ?。?四川省北川羌族自治縣農(nóng)業(yè)局，四川 綿陽 6750；.四川省三臺縣農(nóng)業(yè)局，四川 綿陽 6750；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 60）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的脊椎動物病毒。圓環(huán)病毒1型（PCV1）無致病性，而圓環(huán)病毒2型（PCV2）具有致病性。圓環(huán)病毒2型在臨床上主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、仔豬先天性震顫（CT）、壞死性間質(zhì)性肺炎（PNP）、母豬繁殖障礙等疾病有關(guān)[1]。主要引起豬的多系統(tǒng)功能障礙性疾病，同時PCV2還主要侵害機體的免疫系統(tǒng)，造成豬的免疫抑制，導(dǎo)致了豬群的死亡率大幅增加。此病在世界各國已經(jīng)普遍存在，并且在各大豬場中也已經(jīng)蔓延，對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的威脅和經(jīng)濟損失。

為研究PCV2在四川部分地區(qū)的流行情況，筆者于2015年10月5日至2017年3月14日對四川省成都市、遂寧市、綿陽市、雅安市、南充、樂山、蒲江等7個市縣地區(qū)14個規(guī)?；i場的181份樣品進行了抗原檢測。

1 試驗試劑

蛋白酶K、SDS、Tris飽和酚、引物購自上海生工生物有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000購自大連TaKaRa生物工程有限公司；瓊脂糖購自Biowest公司。試驗過程中使用的其他試劑如氯仿、無水乙醇、異戊醇等均為國產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 臨床觀察和病理學(xué)觀察

對采集的死豬和病料組織進行解剖以及病理變化的觀察，并結(jié)合其臨床特征，初步診斷患豬為圓環(huán)病毒2型感染，最終采用PCR技術(shù)對其進行檢測，統(tǒng)計PCV2的陽性率。并在檢測出的陽性樣品中，討論豬圓環(huán)病毒2型引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）以及豬皮炎腎病綜合征（PDNS）的感染情況。

2.2 引物的設(shè)計和合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PCV2全基因組序列（AF027217），利用Premier express 5軟件針對ORF2基因片段設(shè)計一對特異性引物：上游引物：5'-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3'，下游引物：5'-ACCC CCGCCACCGCTACC-3'。該引物稀釋為 10 pmol/μL，在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 DNA的提取

將組織樣本剪碎后放入研缽，加入少量PBS溶液，研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次后收集于離心管中，7 000 r/min 離心 5 min 取上清液 500 μL，加入 25 μL的蛋白酶 K（20 mg/mL）和 75 μL 的 10%SDS，55 ℃水浴搖床上放置2 h后加入等量Tris飽和酚溶液，10 000 r/min離心10 min，取上清液并加等量的酚∶氯仿∶異戍醇（25∶24∶1）抽提 1 次，最后用兩倍體積無水乙醇沉淀，晾干后加入30 μL蒸餾水溶解沉淀，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 PCV2特異性基因片段的擴增

反應(yīng)體系為：Mix 12.5 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，雙蒸水 7.5 μL，DNA模板3 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 45 s，62℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃總延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后電泳。

2.5 電泳與結(jié)果判定

取5 μL PCR產(chǎn)物加入1.2%瓊脂糖凝膠板加樣孔中。同時取5 μL DNA Marker DL 2 000作為分子量參照物。接通電源，120 V電壓電泳20 min。電泳結(jié)束后將1.2%瓊脂糖凝膠用紫外凝膠成像儀進行觀察，照相。在陽性對照和陰性對照都成立的條件下，如出現(xiàn)一條1 154 bp大小的目的條帶即為陽性，否則判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCV2臨床診斷結(jié)果

在本次試驗調(diào)查獲得的陽性樣品中，大多數(shù)豬群在斷奶后1周左右出現(xiàn)漸進性消瘦、生長遲緩、貧血和黃疸等癥狀，有的豬出現(xiàn)呼吸困難。剖檢表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大，有的還出現(xiàn)肺臟水腫，脾臟腫大、壞死，腎臟衰竭等病理變化。在檢測過程中，此病大多數(shù)感染剛斷奶仔豬，致其死亡。由此可初步懷疑大部分豬場因感染PCV2而致PMWS。

其中綿陽市和遂寧市的6個規(guī)?；i場中檢測到PCV2感染所引起的皮炎和腎炎癥狀：皮膚表面有黑紫色凸起的爛斑；病理變化主要為豬全身淋巴結(jié)腫大，腎臟畸形，腫大呈土黃色，有的腎臟表面有出血點。由此可初步診斷這6個規(guī)模化豬場存在PCV2感染引起的豬皮炎腎病綜合征（圖1和圖 2）。

圖1 皮炎

圖2 腎臟腫大

3.2 PCV2流行病學(xué)調(diào)查

本次試驗從四川省遂寧市、綿陽市、成都市、南充市、雅安市等7個市縣地區(qū)的14個規(guī)?；i場共采集疑似圓環(huán)病毒2型感染的死豬、病料、精液、血樣等樣品181份，提取核酸采用PCR技術(shù)對其進行檢測，檢測結(jié)果詳見表1和圖3。在檢測的181份樣品中，共檢測出陽性樣品89份，得出PCV2陽性率為49.2%。且這14個規(guī)?；i場中均檢測出了PCV2陽性。在死亡的43頭死豬中，有21頭份檢測出了PCV2。病料中的陽性檢出率最高，為54.0%。

表1 樣品PCV2的檢測結(jié)果

3.3 不同病料中檢出PCV2的陽性率

在檢測的21頭PCV2陽性死豬中，分別對其腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、肺臟和腎臟組織處理后，提取核酸，PCR擴增檢測及統(tǒng)計陽性率，結(jié)果見表2。根據(jù)表2結(jié)果可以看出，在檢測的21頭PCV2陽性死豬中，腹股溝淋巴結(jié)的陽性率高達100%，脾臟的陽性率也在90%以上。肺臟和腎臟的陽性率也相對較高，均在80%以上。肝臟的陽性率相對較低，只有66.7%。

表2 21頭PCV2陽性死豬不同病料中PCV2的陽性率

3.4 PCV2陽性率隨季節(jié)的變化

采用PCR技術(shù)對不同季節(jié)采集的疑似圓環(huán)病毒2型感染的樣品進行PCV2檢測，具體結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，在春季檢測數(shù)較多，檢出PCV2陽性率也較高，為51.4%；夏季陽性率為最高，達62.5%；秋季陽性率為48.8%；冬季陽性率最低，只有38.1%。

表3 不同季節(jié)PCV2的陽性率

4 討論

4.1 PCV2在四川地區(qū)的流行情況

本研究調(diào)查該病在四川部分地區(qū)的感染率為49.2%。2013—2015年全國20個檢測單位的報告統(tǒng)計結(jié)果表明，全國PCV2感染的平均陽性率達55.04%[2]。從調(diào)查數(shù)據(jù)可以看出，四川省PCV2的陽性率比早期全國PCV2感染的平均陽性率低，說明四川部分地區(qū)的規(guī)?；i場采取了相應(yīng)的措施防控PCV2的感染，例如接種疫苗、加強飼養(yǎng)管理等，但效果仍不理想。與已報道的北京、河北、山東等省市比較，四川省PCV2的陽性率仍然較高，從而致使患豬免疫力降低，給其他病原入侵提供了機會，大幅增加了豬的死亡率。因此，各豬場還需結(jié)合各自具體情況制定更加全面的防控措施。

4.2 不同組織PCV2檢出結(jié)果

在檢測的21頭陽性死豬中，又分別對腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、肺臟和肝臟進行了PCV2檢測，根據(jù)表2可以看出，腹股溝淋巴結(jié)和脾臟檢出的陽性率特別高，尤其是腹股溝淋巴結(jié)高達100%，這主要與PCV2侵害機體的免疫系統(tǒng)、造成豬的免疫抑制有關(guān)。病毒可在免疫器官大量繁殖，進而引起機體免疫淋巴細胞破壞，這為免疫器官是PCV2復(fù)制的主要場所提供了依據(jù)。李煥榮等[3]研究表明PRRSV和PCV2能相互影響，使豬肺巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)功能較長時間處于失控狀態(tài)，影響了機體免疫應(yīng)答的有效發(fā)揮和對病毒的有效清除，所以在肺臟的檢出陽性率也高達80%以上。而腎臟的較高檢出率可能是與豬圓環(huán)病毒2型所引起的豬皮炎腎病綜合征有關(guān)。

4.3 季節(jié)與豬群PCV2陽性率的關(guān)系

本試驗針對四川省部分地區(qū)規(guī)?；i場不同季節(jié)感染PCV2的情況作了調(diào)查統(tǒng)計，從表3檢測結(jié)果可以看出，四川省近年來春夏季節(jié)圓環(huán)病毒2型感染數(shù)量最多，且夏季PCV2陽性感染率最高，說明在春夏季節(jié)四川省部分地區(qū)的規(guī)模化豬場易感染PCV2。這符合已有報道[4]，PCV2的陽性感染率在春夏季節(jié)高于秋冬季節(jié)[5]。此結(jié)果可能與四川省夏季高濕悶熱、晝夜溫差變化較大有關(guān)，而很多豬場在此期間不能很好地做好豬舍的飼養(yǎng)管理工作，豬群因高濕高熱產(chǎn)生應(yīng)激，導(dǎo)致豬群免疫力下降，患病率和死亡率也相應(yīng)增高。

4.4 混合感染

本研究表明，近年來PCV2已經(jīng)在四川省部分規(guī)?；i場中廣泛流行，而且豬群中PCV2陽性率有上升的趨勢，病毒的混合感染與繼發(fā)的細菌感染情況也較為嚴重，這也是導(dǎo)致豬群死亡率大幅增加的重要原因。在此次豬圓環(huán)病毒2型抗原PCR檢測的同時，還做了其他一些病毒和細菌的檢測，發(fā)現(xiàn)與豬圓環(huán)病毒2型混合感染的主要病毒為豬藍耳病病毒、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒；而繼發(fā)的細菌感染多數(shù)為副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌以及放線桿菌等。說明目前生產(chǎn)實踐中豬圓環(huán)病毒2型病并不是單一發(fā)病[6]，這些混合感染導(dǎo)致豬群死亡率增高。因此各豬場應(yīng)該從免疫檢疫、飼養(yǎng)管理等方面防止圓環(huán)病毒2型感染的發(fā)生，減少豬只應(yīng)激，控制繼發(fā)感染，盡早處理病畜，采取嚴格的生物安全措施以降低損失。

5 結(jié)論

本次調(diào)查的結(jié)果表明，四川省PCV2陽性率為49.2%，且夏季感染率最高。檢測中發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒2型多存在細菌和病毒的混合感染，導(dǎo)致豬群的死亡率增高，說明四川省養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)有豬圓環(huán)病毒2型的感染，并且已經(jīng)對四川省養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的危害。相關(guān)部門和豬場應(yīng)該引起高度重視，加強對本病的防范工作。

[1]王憲文，劉麗艷，姚四新，等.豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（12）：3580-3584.

[2]李棟梁，趙景義，李秀敏.豬圓環(huán)病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及綜合防治措施[J].當代畜牧，2005（8）：11-13.

[3]李煥榮，楊漢春，郭鑫，等.PRRSV和PCV2共感染對豬肺泡巨噬細胞細胞因子IL-10、IL-12p40和IFN-mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，35（4）：382-387.

[4]張治濤，李玉峰，姜平，等.豬圓環(huán)病毒2型感染的檢測與流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（3）：227-231.

[5]陳枝華，張德明.豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀及公共衛(wèi)生學(xué)意義[J].中國人獸共患病雜志，2003，19（3）：113-115.

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