馬素敏,何立超,李成梁,孫 媛,靳國鋒,*,馬美湖

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070;2.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院,湖北武漢 430205)

動物血液是畜禽屠宰加工的主要副產(chǎn)物,動物血液營養(yǎng)全面,其含有豐富的必需氨基酸以及具有高生物利用率的血紅素鐵,同時(shí)血液中的蛋白質(zhì)與乳、豆類中蛋白質(zhì)相比,一般不會引起過敏反應(yīng)[1]。動物血液主要由紅細(xì)胞(占全血體積的20%～40%)和懸浮狀液體血漿(60%～80%)組成。全血中蛋白質(zhì)含量為17%～18%,水分含量為75%～82%,紅細(xì)胞中血紅蛋白含量約占總血液總蛋白質(zhì)含量的70%[2]。

到目前為止,人們對血紅蛋白的開發(fā)利用主要是將其制成增色劑[35]、鐵增強(qiáng)劑、脂肪替代品、動物飼料及寵物食物[6],運(yùn)用于食品加工和營養(yǎng)強(qiáng)化、飼料工業(yè)等領(lǐng)域。近些年也有研究將血紅蛋白進(jìn)行水解制備成具有補(bǔ)鐵、抗菌、抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制等功能活性的配料[6]。同時(shí),血紅蛋白也是合成具有抗腫瘤、抗炎作用的血卟啉等卟啉類化合物的重要原料——氯化血紅素的前體物質(zhì)[7]。此外,也有研究報(bào)道血紅蛋白可作為合成高分子絮凝劑替代品,用于污水處理等分離純化產(chǎn)業(yè)[8]。因此,動物血紅蛋白的開發(fā)利用具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

血紅蛋白產(chǎn)品的開發(fā),其提取工藝是關(guān)鍵,在獲得較高血紅蛋白提取率的基礎(chǔ)上,掌握工藝處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響(如卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)是否完整,血紅素是否從蛋白疏水空穴游離),這樣才能方便其進(jìn)一步開發(fā)利用。血紅蛋白的提取工藝主要分為物理法、化學(xué)法、機(jī)械法,物理方法又分為反復(fù)凍融法和超聲波法,化學(xué)方法主要有添加表面活性劑法以及自溶法,機(jī)械法可以分為膠體磨法、高壓均質(zhì)法以及勻漿機(jī)法等[910]。其中超聲波法具有破碎效率高,時(shí)間短,無有機(jī)試劑殘留、防止剪切黏度升高等優(yōu)點(diǎn)[11],是近年來研究應(yīng)用比較多的一種方法。但是,超聲處理也有其潛在的缺點(diǎn):提高了處理液溫度,并且其強(qiáng)烈的剪切力可能破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶活性喪失,功能特性的改變,蛋白聚集等[12]。有研究報(bào)道[13],超聲波處理不會引起一些具有高水平β結(jié)構(gòu)和低水平α結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(如超氧化物歧化酶、富組親動蛋白等)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,但是會引起一些具有高α螺旋含量蛋白質(zhì)(如肌紅蛋白、牛血清白蛋白)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

目前關(guān)于超聲破碎豬紅細(xì)胞提取血紅蛋白的研究多集中在其工藝的優(yōu)化上,超聲條件對于提取得到的血紅蛋白結(jié)構(gòu)以及其中血紅素卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的影響研究幾乎沒有。本研究利用響應(yīng)面方法優(yōu)化超聲提取血紅蛋白工藝,并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用光譜學(xué)等手段研究了超聲波提取工藝對血紅蛋白及其卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的影響,為后續(xù)研究血紅素等卟啉類化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及開發(fā)相關(guān)卟啉類產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)生鮮超市;標(biāo)準(zhǔn)血紅蛋白 日本東京化成工業(yè)株式會社;檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 均為分析純;Triton X100 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

VCX750型超聲細(xì)胞粉碎儀 美國SONICS公司;Nanodrop 2000C型紫外可見分光光度計(jì) 美國熱電公司;Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國梅特勤公司;JASCOJ810型圓二色譜儀 日本JASCOJ公司;InVia型共焦顯微拉曼光譜儀 英國RENISHAW公司;Sigma330N型冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;ALPHA14型真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACD抗凝劑的制備 稱取檸檬酸0.48 g,檸檬酸鈉1.32 g,葡萄糖1.47 g,溶于100 mL蒸餾水中,高壓滅菌后備用。20 mL新鮮血液加入3.5 mL ACD抗凝劑。

1.2.2 血紅蛋白的超聲提取工藝 取一定體積新鮮抗凝豬血,1700×g離心10 min后血液分層,收集下層紅細(xì)胞,用pH7.4 PBS緩沖液洗滌三次。量取20 mL紅細(xì)胞加入不同體積的蒸餾水,在不同超聲時(shí)間、超聲振幅、脈沖激發(fā)與間歇時(shí)間比下破碎紅細(xì)胞,破碎過程中采用碎冰降溫。破碎液在10000×g下離心30 min,棄下層細(xì)胞碎片收集上清液為血紅蛋白提取液,記錄體積。

1.2.3 血紅蛋白含量測定及計(jì)算 采用堿性羥基高鐵血紅素法測定血紅蛋白含量,在Vinaya等[14]的基礎(chǔ)上稍作變化,按照1∶151比例取血紅蛋白提取液200 μL與30 mL堿性試劑Triton X100進(jìn)行混合。血紅蛋白測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.00185x-0.01111,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。這說明在樣品濃度范圍16～160 mg/mL內(nèi),該方程擬合程度高可用于血紅蛋白濃度的測定計(jì)算。按照下面公式[15]計(jì)算血紅蛋白提取率。

式中,Y為血紅蛋白提取率(%),C1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所求得破碎液中血紅蛋白濃度(mg/mL);V1為20 g紅細(xì)胞加水超聲破碎后的破碎液體積(mL);C2為購買豬血的血紅蛋白濃度(mg/mL);V2為20 g紅細(xì)胞所來源的豬血體積(mL)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.2工藝進(jìn)行超聲破碎紅細(xì)胞提取血紅蛋白,固定超聲時(shí)間為15 min,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為1∶1,水與紅細(xì)胞體積比為3∶1時(shí),研究不同超聲振幅(20%、25%、30%、35%、40%)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為1∶1,水與紅細(xì)胞體積比為3∶1,研究不同超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,超聲時(shí)間為15 min,水與紅細(xì)胞體積比為3∶1,研究不同間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,超聲時(shí)間為15 min,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為1∶1,研究不同水與紅細(xì)胞體積比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)對血紅蛋白提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn),篩選出各因素合適的水平,然后采用Designexpert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),基于BoxBehnken進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平的編碼表如表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 The factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 血紅蛋白結(jié)構(gòu)表征 取一定量在最優(yōu)超聲工藝條件下制備的血紅蛋白凍干樣品(凍干條件為:40 ℃,0.02 MBar,35 h)與標(biāo)準(zhǔn)血紅蛋白,利用紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜、顯微共焦激光拉曼光譜方法研究分析超聲提取工藝對血紅蛋白結(jié)構(gòu)(包括卟啉環(huán))的影響。

1.2.6.1 紫外可見光譜 配制0.1 mg/mL的血紅蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,在200～800 nm下進(jìn)行紫外可見光譜全掃描,對二者的吸收光譜進(jìn)行比較。

1.2.6.2 紅外圖譜分析 采用溴化鉀壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描測定。分別稱取血紅蛋白樣品與標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉末若干,加入一定量溴化鉀進(jìn)行研磨,測定條件設(shè)置為:掃描范圍為4000～400 cm-1,掃描次數(shù)64次,儀器分辨率4 cm-1。

1.2.6.3 圓二色譜 取一定量血紅蛋白樣品和血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于pH7.4的磷酸緩沖液中,配制成濃度為0.05 mg/mL的待測溶液。測定條件:使用0.1 cm的石英比色皿,溫度設(shè)置25 ℃,掃描速率為100 nm/min,掃描范圍為190～260 nm。

1.2.6.4 顯微共焦激光拉曼光譜 取血紅蛋白樣品與標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉末在室溫下進(jìn)行拉曼光譜測定。測定條件為:激光波長633 nm,激光分辨率2 cm-1,掃描波數(shù)范圍:200～2000 cm-1,激光功率15 mW。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用origin 8.5軟件繪制實(shí)驗(yàn)折線圖。采用Designexpert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及方差分析,得到響應(yīng)面設(shè)計(jì)表及方差分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲振幅對紅細(xì)胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖1可以看出,當(dāng)其它因素一定時(shí),隨著超聲振幅的增加,血紅蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)超聲振幅達(dá)到25%時(shí),血紅蛋白提取率達(dá)到最高。超聲振幅與輸出超聲功率呈現(xiàn)良好線性關(guān)系[11],而超聲空化作用和超聲波功率有關(guān),振幅越大,輸出超聲功率越大,空化作用強(qiáng)度越大,則紅細(xì)胞破碎越完全。但振幅太大,空化作用會趨于飽和,同時(shí)也容易產(chǎn)生局部過熱使得已溶出的血紅蛋白發(fā)生聚集沉淀[16]和導(dǎo)致部分紅細(xì)胞變性,從而阻礙了血紅蛋白的釋放[17]。因此,在破碎過程中要注意采取碎冰降溫或者其它降溫方式。

圖1 超聲振幅對血紅蛋白提取率的影響Fig.1 The effects of ultrasonic amplitude on hemoglobin yield

2.1.2 超聲時(shí)間對紅細(xì)胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖2可以看出,當(dāng)其它因素一定時(shí),隨著超聲時(shí)間的增加,血紅蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到10 min時(shí),血紅蛋白提取率達(dá)到最高。也就是說10～25 min之間,血紅蛋白提取率隨著超聲作用時(shí)間的延長而降低,這是因?yàn)槌晻r(shí)間越長,超聲波在破碎細(xì)胞的同時(shí)產(chǎn)生的空化氣泡越多并且釋放的熱量形成的瞬間高溫會對紅細(xì)胞產(chǎn)生加熱作用,時(shí)間越長,被加熱的紅細(xì)胞數(shù)目越多,這可能會使部分紅細(xì)胞變性[17],從而阻礙了血紅蛋白的釋放,同時(shí)長時(shí)間的超聲作用會使得已溶出血紅蛋白由于非共價(jià)作用聚集沉淀[16],從而使得血紅蛋白提取率降低了。

圖2 超聲時(shí)間對血紅蛋白提取率的影響Fig.2 The effects of ultrasonic time on hemoglobin yield

2.1.3 間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比對紅細(xì)胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖3可以看出,隨著間歇時(shí)間(s)與脈沖激發(fā)時(shí)間(s)比值的逐漸增大,血紅蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)二者比例為2∶1時(shí),血紅蛋白提取率達(dá)到最大。間歇時(shí)間與超聲波空化作用和熱效應(yīng)息息相關(guān),是消除超聲波熱效應(yīng)的有效手段之一。間歇時(shí)間里容易產(chǎn)生氣泡,大大提高了超聲過程中發(fā)生空化作用的機(jī)率[18],空化產(chǎn)生的極大壓力使得更多的紅細(xì)胞更容易破碎,因此血紅蛋白含量會升高。當(dāng)間歇時(shí)間一定時(shí),脈沖激發(fā)時(shí)間越長即超聲時(shí)間越長,血紅蛋白提取率先增加后減少這與前面的結(jié)論也是一致的。

圖3 間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比對血紅蛋白提取率的影響Fig.3 The effects of ratios of quiescent interval to impluse excitation time on hemoglobin yield

2.1.4 水與紅細(xì)胞體積比對紅細(xì)胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖4可以看出,當(dāng)其它因素一定時(shí),隨著水與紅細(xì)胞體積比的增加,血紅蛋白提取率呈現(xiàn)上升趨勢,當(dāng)加水量達(dá)到紅細(xì)胞體積的4倍后時(shí),血紅蛋白提取率增加緩慢。這是因?yàn)榧尤胨蠹t細(xì)胞細(xì)胞膜外的滲透壓降低了從而導(dǎo)致紅細(xì)胞吸水脹破,同時(shí)超聲波的空化作用也加速了紅細(xì)胞的破碎,因而血紅蛋白提取率升高[19]。但是從經(jīng)濟(jì)方面和后續(xù)實(shí)驗(yàn)考慮,4倍加水體積后血紅蛋白提取率增加緩慢,且加水量過多使血紅蛋白濃度降低較多,不利于后期酶解實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,因此初步確定加水量為紅細(xì)胞體積的4倍。

圖4 水與紅細(xì)胞體積比對血紅蛋白提取率的影響Fig.4 The effects of volume ratios of water to red blood cell on hemoglobin yield

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用BBD組合實(shí)驗(yàn),以血紅蛋白提取率作為響應(yīng)值,分別考察超聲振幅、超聲時(shí)間、間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比以及水與紅細(xì)胞體積比對超聲破碎紅細(xì)胞制備血紅蛋白的影響。由Designexpert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分組及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 The scheme and results of response surface experiment

表3 模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis result of model variance

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 通過響應(yīng)面分析軟件得到的三維曲面圖和二維等高線圖可以很直觀的反映各因素間的交互作用。圖5反應(yīng)的是對血紅蛋白提取率具有顯著影響的三個(gè)交互作用即 AB、AC、AD的三維圖像(a1、b1、c1)以及二維等高線(a2、b2、c2),可以看出b1的曲面最陡峭,b2的二維等高線最接近橢圓形,這說明AC的交互作用即超聲振幅和間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比的交互作用最強(qiáng),對血紅蛋白提取率的影響極顯著[21]。

圖5b1所示為AC交互作用的三維曲面圖。當(dāng)超聲時(shí)間和水與紅細(xì)胞體積比分別固定在10 min和4∶1時(shí),血紅蛋白提取率達(dá)到最大預(yù)測值時(shí)的超聲振幅為25.79%,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為1.89∶1。在超聲振幅和間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比的范圍內(nèi),當(dāng)間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比較低時(shí),血紅蛋白提取率隨著超聲振幅的增加而快速增加,隨著超聲振幅的連續(xù)增加,提取率緩慢下降;當(dāng)間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比較高時(shí),血紅蛋白提取率隨著超聲振幅的增加而增加緩慢,隨著超聲振幅的進(jìn)一步增加,提取率快速降低。當(dāng)超聲振幅較低時(shí),隨著間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比的增加,血紅蛋白提取率也增加;當(dāng)超聲振幅較高時(shí),提取率隨著間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比的增加而減少[22]。其次,超聲振幅的響應(yīng)曲面比間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比的響應(yīng)曲面陡峭,說明超聲振幅對血紅蛋白提取率的影響高于間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比。這與上述的方差分析結(jié)果相符合。

圖5 AB、AC、AD的交互作用對血紅蛋白提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters(AB,AC,AD)on the yield of hemoglobin

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過響應(yīng)面優(yōu)化出最優(yōu)條件為:超聲振幅26.03%,超聲時(shí)間10.14 min,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為1.86∶1,水與紅細(xì)胞的體積比為4.27∶1,此時(shí)血紅蛋白提取率為92.8136%。根據(jù)實(shí)際情況,選擇超聲振幅為26%,超聲時(shí)間為10.15 min,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為2∶1,水與紅細(xì)胞體積比為4.25∶1,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得的血紅蛋白提取率為91.4763%,與回歸方程所得的預(yù)測值相差1.34%,由此可認(rèn)為實(shí)測值與預(yù)測值具有良好的吻合性,該回歸模型與實(shí)際情況擬合良好,具有較好的預(yù)測性。本文通過響應(yīng)面優(yōu)化出的最佳血紅蛋白提取率(91.4763%)與郝玉蘭等[15]的研究結(jié)果(92.33%)近似,但最優(yōu)超聲時(shí)間與超聲功率都比之降低,分析原因可能是采用的動物血液品種及來源不同、超聲波裝置及型號不同,故破碎效果不同。

2.3 超聲提取工藝對血紅蛋白結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的紫外可見圖譜分析 血紅蛋白的紫外可見吸收光譜中出現(xiàn)的電子帶分別為:280 nm(色氨酸,酪氨酸中苯基)、360 nm(ε帶)、406 nm(Soret帶)、576 nm(Q帶)[23],其中與位于血紅蛋白疏水口袋中的血紅素密切相關(guān)的電子條帶為:Soret帶以及Q帶,它們也是卟啉類化合物鑒別的重要特征。Soret帶的強(qiáng)度、位置、形狀與卟啉環(huán)聯(lián)系緊密,Q帶的位置則反映了血紅素周圍環(huán)境的變化[24]。如圖6所示,超聲后血紅蛋白相較于未超聲血紅蛋白而言,Soret帶紅移了近3 nm,且Q帶的位置、形狀也發(fā)生了變化,由單峰變化為肩峰。說明血紅蛋白經(jīng)過超聲處理后其蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生變化,且血紅蛋白配體血紅素基團(tuán)在這個(gè)過程中也受到擾動,但其結(jié)構(gòu)即卟啉環(huán)并未發(fā)生斷裂(Soret帶仍存在)。

圖6 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的紫外圖譜Fig.6 UVVis spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample 注:a:未超聲血紅蛋白;b:超聲后血紅蛋白;圖7～圖9同。

2.3.2 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的紅外光譜分析 在紅外光譜中,酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶可以提供蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的信息。酰胺Ⅰ帶反映的是C=0伸縮振動,常出現(xiàn)于1600～1700 cm-1范圍內(nèi),提供蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)信息。酰胺Ⅱ帶是NH彎曲振動及CN伸縮振動的偶合峰,常出現(xiàn)于1500～1600 cm-1[25]。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶能更敏銳的反應(yīng)出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化,因此分析酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶變化更有利于分析超聲條件對血紅蛋白結(jié)構(gòu)變化的影響[25]。如圖7所示,與未超聲Hb相比較,超聲后血紅蛋白樣品的酰胺I帶吸收峰位置由1654 cm-1偏移至1656 cm-1,酰胺II帶吸收峰位置由1539 cm-1轉(zhuǎn)移至1540 cm-1,并且經(jīng)過超聲處理后兩峰強(qiáng)度都減弱,這表明超聲處理使得血紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[26]。

圖7 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的紅外圖譜Fig.7 FTIR spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

2.3.3 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的圓二色譜分析 如圖8所示,以未超聲血紅蛋白作為對照,其在194 nm處有一正峰,在210 nm以及222 nm處各存在一負(fù)峰[27],可以發(fā)現(xiàn),超聲處理后的樣品在194 nm處的正峰強(qiáng)度增強(qiáng),在兩負(fù)峰處的強(qiáng)度減弱,并且位于210 nm處峰出現(xiàn)稍微紅移的現(xiàn)象,這表明超聲處理后血紅蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)損失。α螺旋比其它二級結(jié)構(gòu)如β折疊等更緊密,它們一起維持蛋白穩(wěn)定。超聲處理后的血紅蛋白其α螺旋所占比例相較于未超聲血紅蛋白的86.6%降低至60.3%,β折疊則由4.7%上升至26.1%。α螺旋的減少和β折疊的增加會導(dǎo)致血紅素中心暴露[28]。通過上述現(xiàn)象可以得出,超聲破碎紅細(xì)胞制備血紅蛋白樣品這一過程對血紅蛋白的結(jié)構(gòu)有一定影響,會引起蛋白結(jié)構(gòu)變化,從而使血紅素暴露出來。

圖8 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的圓二色譜圖Fig.8 CD spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

2.3.4 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的顯微共焦激光拉曼光譜分析 血紅蛋白拉曼光譜因血紅素的拉曼散射截面相對而言較大,因此主要反映的是血紅素的一些振動特征[29]。與血紅素密切相關(guān)的一些標(biāo)志峰多集中在低頻區(qū),而具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的拉曼譜帶則多集中在高頻區(qū)。圖9中,未超聲血紅蛋白拉曼強(qiáng)度約是超聲后血紅蛋白拉曼強(qiáng)度的8陪。未超聲血紅蛋白和超聲后血紅蛋白樣品均在低頻區(qū)有兩個(gè)較顯著的峰,分別是ν1(670±2) cm-1以及ν2(756±4) cm-1,對應(yīng)的分別是Fe與配體以及卟啉環(huán)的特征峰[30,31],同樣地,在高頻區(qū)中的ν4(1453±2) cm-1,ν5(1584±2) cm-1是血紅素鐵與各配位體結(jié)合的特征峰,ν31399 cm-1是表征血紅素氧化狀態(tài)的特征峰[32]。這些與血紅素卟啉環(huán)密切相關(guān)的特征峰在超聲處理前后都存在,僅僅拉曼峰強(qiáng)度減弱,這初步說明超聲處理得到的血紅蛋白的卟啉環(huán)并未斷裂,這與紫外圖譜分析結(jié)果一致。但是由于血紅素四周蛋白結(jié)構(gòu)在超聲作用下發(fā)生變化,導(dǎo)致血紅素狀態(tài)也發(fā)生變化(血紅素中心從疏水性內(nèi)穴暴露在外,熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng),對拉曼測定造成一定干擾),因此峰強(qiáng)度大大減弱。

圖9 超聲處理對血紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的顯微共焦激光拉曼光譜Fig.9 Confocal MicroRaman spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對超聲波破碎紅細(xì)胞提取血紅蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化,最終響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為:超聲振幅為26%,超聲時(shí)間為10.15 min,間歇與脈沖激發(fā)時(shí)間比為2∶1,水與紅細(xì)胞體積比為4.25∶1,此時(shí)血紅蛋白提取率為91.4763%。在此工藝基礎(chǔ)上,研究了超聲處理對提取得到的血紅蛋白結(jié)構(gòu)及其中卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的影響,得出該超聲工藝會使血紅蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而會使得疏水空穴中的血紅素暴露出來,但是其中卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生斷裂。這為后續(xù)進(jìn)一步研究卟啉環(huán)上的取代反應(yīng)、開發(fā)相關(guān)卟啉類產(chǎn)品打下了一定基礎(chǔ)。

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