王紫華

﹝上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，河南 商丘 476000﹞

氨甲苯酸是臨床上常用的止血藥。用該藥進(jìn)行止血的機(jī)制為：血液循環(huán)中存在各種纖溶酶（原）的天然拮抗物。氨甲苯酸可競(jìng)爭(zhēng)性地阻滯纖溶酶原吸附在纖維蛋白網(wǎng)上，防止纖溶酶被激活、纖維蛋白被纖溶酶降解，從而發(fā)揮止血的作用[1]?，F(xiàn)行的氨甲苯酸原料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)（用滴定分析法進(jìn)行含量測(cè)定，用顏色控制終點(diǎn)）僅可對(duì)藥品中的總雜進(jìn)行控制，且操作過(guò)程較為繁瑣、檢測(cè)結(jié)果的誤差較大[2]。有研究結(jié)果證實(shí)，用高效液相色譜法（HPLC法）測(cè)定氨甲苯酸原料含量的專屬性要優(yōu)于用滴定分析法進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。在本次研究中，筆者根據(jù)《中國(guó)藥典》（2010年版第二部）附錄XIXA 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[3]，在參考現(xiàn)行的氨甲苯酸原料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自制氨甲苯酸原料的合成工藝，用自擬的HPLC法測(cè)定氨甲苯酸原料的含量及有關(guān)物質(zhì)，以期更好地控制該藥品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（包含流動(dòng)相瓶、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、G1314F VWD檢測(cè)器、Agilent chemStation 色譜工作站，由安捷倫公司生產(chǎn)）及CPA225D 電子分析天平（由賽多利斯公司生產(chǎn)）。

1.2 試藥

氨甲苯酸對(duì)照品（批號(hào)：100921-200701，純度：99.8%，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）、對(duì)氯甲基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：20120421，純度：99.9%，自制）、對(duì)氰基氯芐（批號(hào)：20120311，純度：99.8%，由連云港三諾化工有限公司生產(chǎn)）、乙腈（為色譜純）、水（為超純水）、其他試劑（為分析純）、氨甲苯酸原料樣品（批號(hào)分別為S12052361、S12052461、S12052561，均為自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備方法

精密稱取20 mg的氨甲苯酸原料樣品（批號(hào)：S12052361），向其中加入水，將其溶解、稀釋至50 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動(dòng)相，將其稀釋至10 ml后混合均勻，將該溶液作為供試品溶液。精密稱取20 mg的氨甲苯酸對(duì)照品（批號(hào)：100921-200701），用與配制供試品溶液相同的方法配制對(duì)照品溶液。供試品溶液和對(duì)照品溶液的濃度均為40 μg/ml。

2.2 自擬HPLC的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2.1 色譜條件 色譜柱：氨基鍵合硅膠柱（Ultimate XBNH2，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈 -0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（比例為69：31，用磷酸將其pH調(diào)節(jié)為4.0），樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm，流動(dòng)相的流動(dòng)速度：1.0 ml/min，樣品的進(jìn)樣量：10 μl，色譜柱的溫度：30℃。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密稱取40 mg的氨甲苯酸對(duì)照品，向其中加入水，將其溶解、稀釋至10 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動(dòng)相，將其稀釋至10 ml后搖勻。分別按自擬的色譜條件和現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)色譜條件進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，在自擬的色譜條件下，氨甲苯酸對(duì)照品溶液的主峰保留時(shí)間較短（可節(jié)約檢測(cè)時(shí)間），且其峰對(duì)稱性較好、塔板數(shù)較大、系統(tǒng)適用性良好、分離度和重復(fù)性均較好，證實(shí)該色譜條件優(yōu)于現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)色譜條件。

2.3 自擬HPLC的檢測(cè)限和定量限

取10.08 mg的氨甲苯酸對(duì)照品，將其置于50 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加水，將其溶解、稀釋至刻度，配制成100%溶液。取1 ml的該100%溶液，將其置于100 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動(dòng)相至刻度，配制成1%溶液。取1 ml的該1%溶液，將其置于100 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動(dòng)相至刻度，配制成0.01%溶液。取3 ml的該0.01%溶液，將其置入20 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動(dòng)相至刻度，即得到氨甲苯酸檢測(cè)限溶液的濃度（0.003204 μg/ml）。另取1 ml上述的1%溶液，將其置入10 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動(dòng)相至刻度，配制成0.1%溶液。取1 ml的該0.1%溶液，將其置于20 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動(dòng)相至刻度，即得到氨甲苯酸定量限溶液的濃度（0.01008 μg/ml）。分別精密量取10 μl的氨甲苯酸檢測(cè)限溶液和定量限溶液，將這兩種溶液注入液相色譜儀。在色譜儀的信噪比約為3時(shí)，得到氨甲苯酸的最低檢出量。經(jīng)計(jì)算，該最低檢出量為0.03204 ng。在色譜儀的信噪比約為10時(shí)，得到氨甲苯酸的定量限。經(jīng)計(jì)算，該定量限為0.1008 ng 。

2.4 自擬HPLC的線性范圍

精密稱取50 mg的氨甲苯酸對(duì)照品，向其中加水，將其溶解、稀釋至50 ml后混勻。精密量取7份上述的稀釋液，用流動(dòng)相將其分別稀釋成濃度為500 μg/ml、400 μg/ml、200 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml的溶液。按擬定的色譜條件，分別精密量取10 μl上述不同濃度的溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)的峰面積分別為23370.60、18855.00、9468.74、1917.07、956.20、190.74、94.94。以這7份樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以其峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得出方程：y=46862x+30.378，r=1。結(jié)果表明，在擬定的色譜條件下，當(dāng)氨甲苯酸對(duì)照品的進(jìn)樣量在2～500μg/ml范圍內(nèi)時(shí)，峰面積與樣品濃度的線性關(guān)系良好，符合藥典規(guī)定的分析方法驗(yàn)證要求。

2.5 自擬HPLC的精密度（重復(fù)性）試驗(yàn)

《中國(guó)藥典》（2010年版第二部）規(guī)定：精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，對(duì)同一個(gè)均勻供試品進(jìn)行多次測(cè)定后所得結(jié)果之間的接近程度。一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）對(duì)精密度進(jìn)行考察（RSD≤1.0%）。取氨甲苯酸原料樣品（批號(hào)：S12052361），將其分別配制成6份供試品溶液。用自擬的HPLC對(duì)這6份供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，其含量分別為100.18%、99.99%、99.78%、99.83%、99.74%、99.70%，其含量的平均值為99.87%，其含量的RSD為0.2%。這一檢測(cè)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的精密度良好。

3 對(duì)氨甲苯酸原料樣品中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)

精密稱取40 mg的氨甲苯酸原料樣品（批號(hào)：S12052361），向其中加入水，將其溶解、稀釋至10 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動(dòng)相，將其稀釋至10 ml，制成供試品溶液。精密量取1 ml的供試品溶液，向其中加入流動(dòng)相，將其稀釋至100 ml，制成對(duì)照溶液。用自擬的HPLC檢測(cè)3批（批號(hào)分別為S12052361、S12052461、S12052561，均為自制）氨甲苯酸原料樣品的最大單雜和總雜（要求：最大單雜≤0.1%，最大總雜≤0.5%），結(jié)果顯示，其單雜分別為0.028%、0.021%、0.020%，其總雜分別為0.042%、0.038%、0.033%。用現(xiàn)行的滴定分析法對(duì)這3批氨甲苯酸原料樣品進(jìn)行總雜（要求：最大總雜≤1.0%）檢測(cè)的結(jié)果分別為0.030%、0.021%、0.020%。

4 對(duì)氨甲苯酸原料樣品含量的測(cè)定

按“2.1”中使用的供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備方法重新配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，用自擬的HPLC法對(duì)新制備的供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，按外標(biāo)法計(jì)算其峰面積，結(jié)果顯示，這3批氨甲苯酸原料樣品的含量分別為99.61%、99.66%、99.58%。用現(xiàn)行的滴定分析法對(duì)這3批氨甲苯酸原料樣品進(jìn)行含量檢測(cè)（要求：含量≥98.0%）的結(jié)果分別為99.86%、99.86%、99.85%。

5 討論

5.1 用自擬的HPLC檢測(cè)氨甲苯酸原料波長(zhǎng)的選擇依據(jù)

對(duì)氨甲苯酸溶液進(jìn)行紫外掃描的結(jié)果顯示，其在235 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。合成工藝的起始原料對(duì)氰基氯芐、中間體對(duì)氯甲基苯甲酸、氨甲苯酸自身的降解雜質(zhì)在該波長(zhǎng)處均能與主藥進(jìn)行良好的分離，且能被有效地檢測(cè)，故選擇235 nm作為用自擬的HPLC檢測(cè)氨甲苯酸原料的波長(zhǎng)。

5.2 用自擬的HPLC檢測(cè)氨甲苯酸原料流動(dòng)相的選擇依據(jù)

在本次研究中，筆者將自擬HPLC的流動(dòng)相﹝乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（比例為69：31，用磷酸將其pH調(diào)節(jié)為4.0）﹞與現(xiàn)行滴定分析法的流動(dòng)相﹝乙腈-水溶液（比例為3：1，在200 ml的水中加入1滴冰醋酸，再加入4.0%的氫氧化鈉溶液，將其pH調(diào)節(jié)至7.4）﹞進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，自擬HPLC的流動(dòng)相其主峰保留的時(shí)間較短，其適用性較好，故將其作為檢測(cè)氨甲苯酸原料的流動(dòng)相。

[1]氨甲苯酸注射液說(shuō)明書湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司[Z]. 2007.2.

[2]《中華人民共和國(guó)藥典》1995年版.二部[S].1995:737-738.

[3]《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版.二部[S].2010:194-195.