王 鑫 張萌萌 姜 寧 張愛忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319)

宿主防御肽(HDPs)也稱為抗菌肽，是動物先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其具有廣譜的抗革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、真菌、病毒、原生動物甚至癌細胞的抗微生物活性，大多數(shù)HDPs在黏膜表面(包括胃腸道)均有表達。HDPs的主要種類有防御素、cathelicidins、S100家族、RNase A超家族、再生胰島衍生Ⅲ(REGⅢ)C型凝集素和肽聚糖識別蛋白[1]。由于大多數(shù)HDPs帶正電荷或具有兩親性，它們主要通過破壞細胞膜或與細胞內(nèi)大分子相互作用來殺死細菌。通過靜電相互作用，帶正電荷的HDPs與細菌膜上帶負電的磷脂基團結(jié)合。HDPs的兩親性使其易于插入靶細胞膜中，從而破壞細胞膜的完整性。在細胞內(nèi)，某些HDPs也能夠抑制蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成，或者與特異性靶標(biāo)結(jié)合。除抗菌活性外，HDPs還參與調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。譬如，3種雞源cathelicidins(fowlicidin1、fowlicidin2和fowlicidin3)直接與細菌細胞壁外膜中的脂多糖(LPS)結(jié)合，具有中和LPS誘導(dǎo)巨噬細胞炎性細胞因子產(chǎn)生的能力[2]。3種牛源β牛防御素[牛中性粒細胞β-防御素3(BNBD3)、牛中性粒細胞β-防御素9(BNBD9)和牛腸源性防御素(EBD)]對未成熟的單核細胞來源的樹突細胞具有趨化性[3]。豬源cathelicidin PR-39還能抑制吞噬細胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，并通過阻斷結(jié)合p47phox(一種NADPH氧化酶的胞質(zhì)成分)而抑制酶復(fù)合物的合成來減弱心肌缺血再灌注損傷[4]。因此，具有有效抗菌活性和調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的HDPs被積極開發(fā)成新型抗生素。最近研究表明，HDPs能直接調(diào)節(jié)黏蛋白、緊密連接(TJ)蛋白的表達和微生物群落的組成，以增強黏膜屏障的通透性。HDPs在腸道屏障功能和腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中的新作用將作為本文的論述重點。

1 動物腸道屏障功能概述

胃腸道內(nèi)的單層上皮細胞除可促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收外，還可作為微生物和毒素入侵的屏障，其是通過用黏液層涂覆上皮細胞并在上皮細胞之間形成選擇滲透性屏障的手段來實現(xiàn)腸道屏障功能。黏液層主要由杯狀細胞分泌的黏蛋白組成，其可作為腸腔內(nèi)容物和宿主之間的物理屏障，并且還有助于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。改變黏蛋白的表達或糖基化通常與腸屏障功能障礙有關(guān)。例如，小鼠的黏蛋白2(MUC2)基因缺陷導(dǎo)致腸道上皮細胞滲透性增加、大出血、胃腸道炎癥以及嚴重的生長遲緩[5]。黏蛋白1(MUC1)或MUC2基因缺陷型小鼠變得更容易感染空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及鼠檸檬酸桿菌。此外，缺乏β-1,3-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的小鼠表現(xiàn)出較薄的黏液層，增加了腸道細菌感染和葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性[6]。

胃腸道的主要屏障功能表現(xiàn)在上皮細胞中，上皮細胞通過2種途徑(即跨細胞和旁細胞途徑)轉(zhuǎn)運水、離子和大分子?？缂毎肥侵感》肿又鲃踊虮粍愚D(zhuǎn)運通過上皮細胞的運動，而旁細胞通路是指上皮細胞之間的水、大分子和免疫細胞的擴散。在完整的上皮細胞中，旁細胞通路決定了腸道的通透性并由上皮之間連接調(diào)節(jié)，被稱為TJ。腸上皮是由幾種不同類型的細胞組成的隱窩和絨毛。這些細胞包括腸上皮干細胞、腸上皮細胞和腸內(nèi)分泌細胞，如潘氏細胞、杯狀細胞和腸內(nèi)分泌細胞[7]。腸上皮干細胞能分化出所有類型的上皮細胞，而腸上皮細胞主要在營養(yǎng)物質(zhì)吸收中起作用，并具有合成和釋放HDPs及黏蛋白的能力。潘氏細胞和杯狀細胞分別是HDPs和黏蛋白的主要生產(chǎn)者，而腸內(nèi)分泌細胞主要分泌許多激素，作為消化功能的調(diào)節(jié)劑[7]。通過形成3種主要類型的連接復(fù)合物，即TJ、黏附連接和橋粒，所有腸上皮細胞與側(cè)膜連接[8]?？傮w而言，這些連接復(fù)合物形成了對細胞間隙幾乎不可滲透的密封。除了屏障功能外，這些連接復(fù)合物通過將頂端與基底外側(cè)膜分離來維持細胞極性[9]。TJ是位于側(cè)膜最頂端的多蛋白復(fù)合物，由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白組成，這些蛋白直接與細胞骨架相互作用。在這3種主要的連接復(fù)合物中，只有TJ具有控制離子、水和小分子的選擇性旁細胞通透性的能力[9]。因此，TJ是黏膜上皮滲透性的主要決定因素。

維持黏蛋白和TJ裝配能確保營養(yǎng)物質(zhì)、水、電解質(zhì)的吸收和運輸，同時使宿主免受病原體、毒素和腸道菌群的影響。同時，黏液層和TJ復(fù)合物的破壞會導(dǎo)致腸滲透性增加，隨后細菌移位加劇，炎癥加劇，并可能引起各種腸道和系統(tǒng)性疾病。在畜牧生產(chǎn)中，腸道屏障功能受損將影響動物健康，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降[10]。因此，了解HDPs如何維持和調(diào)節(jié)腸道屏障功能以實現(xiàn)最佳動物健康狀態(tài)和生產(chǎn)性能將顯得至關(guān)重要。

2 HDPs對腸道屏障功能的分子調(diào)節(jié)機制

2.1 HDPs誘導(dǎo)黏蛋白和TJ蛋白表達的細胞受體

許多細胞外和細胞內(nèi)受體影響著人和小鼠中cathelicidin和防御素的一系列生理功能。人源抗菌肽LL-37和鼠源陽離子相關(guān)抗菌肽(CRAMP)是P2X嘌呤能受體7(P2X7)、甲酰肽受體樣1/2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及sequestosome-1/p62的配體，而幾種人類和小鼠β-防御素與CC趨化因子受體2(CCR2)、CC趨化因子受體6(CCR6)、CXC趨化因子受體2(CXCR2)以及Toll樣受體(TLR)1/2/4結(jié)合[11]。盡管表皮生長因子受體(EGFR)不是LL-37的直接受體，但LL-37誘導(dǎo)的肺上皮細胞中的氣道黏液黏蛋白(MUC5AC)基因的表達似乎主要通過EGFR的反式激活介導(dǎo)[12]。最初，LL-37觸發(fā)腫瘤壞死因子(TNF-α)轉(zhuǎn)換酶的活化，依次切割TNF-α結(jié)合形式，但不切斷肝素結(jié)合表皮生長因子(EGF)；釋放的TNF-α隨后與EGFR相互作用并使其磷酸化，其通過激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)MUC5AC基因的表達[12]。對于LL-37在人腸上皮細胞中誘導(dǎo)MUC2和黏蛋白3(MUC3)基因的表達，涉及EGFR和P2X7，但不涉及G蛋白偶聯(lián)受體[13]。在人腸上皮細胞中HBD-2誘導(dǎo)的黏蛋白表達是通過CCR6部分介導(dǎo)的[14]。

2.2 HDPs調(diào)節(jié)腸道屏障的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38組成的3個典型信號級聯(lián)[15]。S100A7能夠激活這3個典型的信號級聯(lián)。ERK在暴露于S100A7后2 min內(nèi)迅速在人皮膚角質(zhì)細胞中磷酸化，JNK和p38 MAPK也在30 min內(nèi)被磷酸化。p38 MAPK參與調(diào)節(jié)人Caco-2細胞中MUC2產(chǎn)生的P2X7和EGFR活化[12]。抑制單個MAPK信號級聯(lián)將顯著降低跨表皮電阻(TEER)，這意味著3個主要的MAPK途徑都是必需的。抑制ERK途徑增強了丁酸-腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)協(xié)同作用，而阻斷JNK或p38途徑顯著降低了雞巨噬細胞和空腸外植體對禽β-防御素9(AvBD9)的誘導(dǎo)[16]。丁酸鈉激活了牛乳腺上皮細胞中TLR2/p38細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)了氣管抗菌肽(TAP)、牛中性粒細胞β-防御素5(BNBD5)、牛中性粒細胞β-防御素10(BNBD10)的表達，提高了抗金黃色葡萄球菌感染內(nèi)化的能力并發(fā)揮抗炎作用[17]。丁酸鈉誘導(dǎo)PK-15細胞中的豬β-防御素3(pBD3)、豬防御素EP2C(pEP2C)、豬β-防御素128(pBD128)、豬β-防御素123(pBD123)和豬β-防御素115(pBD115)表達上調(diào)，但沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時，TLR2可被丁酸鈉和肽聚糖激活，阻斷TLR2表達，抑制了HDPs的誘導(dǎo)[18]。TJ蛋白的翻譯后修飾和相關(guān)的肌動球蛋白環(huán)的狀態(tài)對屏障滲透性會有很大的影響。許多因子通過某些TJ蛋白的磷酸化或通過肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的激活來改變屏障功能，MLCK又使肌球蛋白輕鏈磷酸化并引起功能性肌動球蛋白環(huán)的收縮和細胞旁孔的開放。確定HDPs是否以及如何影響TJ蛋白的翻譯后修飾以及MLCK的轉(zhuǎn)錄和活性將是后續(xù)研究熱點之一。

2.3 HDPs調(diào)節(jié)腸道黏蛋白和TJ蛋白的合成

人β-防御素-2(HBD-2)上調(diào)人結(jié)腸上皮細胞HT-29中MUC2、MUC3 mRNA的表達，但不上調(diào)MUC1或MUC5ACmRNA的表達[13]。相對于HBD-2，人結(jié)腸上皮細胞Caco-2中MUC2 mRNA的表達也上調(diào)，而表達上調(diào)的MUC2又促進HBD-2 mRNA的表達，暗示MUC2與HBD-2之間存在正反饋調(diào)節(jié)機制[19]。LL-37在HT-29細胞中對MUC1、MUC2和MUC3 mRNA的表達均有增強作用，在Caco-2細胞中僅對MUC3 mRNA的表達有增強作用[13]。buforin Ⅱ是一種從亞洲蟾蜍的胃中分離出來的含21個氨基酸的HDPs，可改善受3種產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)菌株攻擊的斷奶仔豬的腸道屏障功能[20]。口服給藥buforin Ⅱ誘導(dǎo)受大腸桿菌攻擊仔豬的空腸節(jié)段中claudin-1、occludin和ZO-1蛋白的表達增加。重要的是，buforin Ⅱ還可改善腸道形態(tài)和生長性能，并減少糞便拭子中的細菌脫落。此外，使用稱為cathelicidin-BF的帶狀krait HDPs能誘導(dǎo)健康小鼠空腸中ZO-1蛋白的表達，并恢復(fù)LPS介導(dǎo)的ZO-1損傷和腸道屏障功能[21]。此外，pBD-2能恢復(fù)MUC1、MUC2 mRNA的表達，claudin-1、ZO-1和ZO-2蛋白的表達以及DSS處理小鼠結(jié)腸屏障的完整性[22]。

3 HDPs對腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的影響

腸上皮細胞的主要功能之一是作為抵抗微生物入侵的屏障。腸黏膜上有1 000多種微生物定植，其中大多數(shù)是共生細菌，通過這些細菌來改善消化、吸收和維生素合成的能力，從而有益于宿主，同時還能限制病原體繁殖。存在于人和小鼠腸道中的2種最主要的細菌是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，它們合計存在的細菌數(shù)占總細菌數(shù)的70%～80%。共生細菌對正常腸道形態(tài)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。盡管共生細菌在穩(wěn)態(tài)條件下對宿主是有益的，但是在穩(wěn)態(tài)失調(diào)或微生物群落失衡的狀態(tài)下會導(dǎo)致炎癥和上皮細胞動態(tài)平衡紊亂。

腸上皮通過模式識別受體(PRR)和微生物相關(guān)分子模式(MAMP)之間的相互作用持續(xù)監(jiān)測定植微生物。激活PRR能刺激腸細胞中HDPs和黏蛋白的合成和釋放。Paneth細胞和腸上皮細胞分泌的大量HDPs被保留在黏液層中，以形成強大的屏障抵抗細菌入侵。HDPs敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究已經(jīng)闡明了HDPs在腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和免疫防御中的作用。敲除小鼠cathelicidinCRAMP基因會引發(fā)小鼠結(jié)腸炎，并且在DSS誘導(dǎo)后疾病癥狀進一步惡化[23]。從野生型小鼠向CRAMP基因敲除小鼠轉(zhuǎn)移骨髓細胞減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。攜帶人類防御素5(HD5)轉(zhuǎn)基因的小鼠表現(xiàn)出增強抵御口服鼠傷寒沙門氏菌感染的能力。相反，產(chǎn)生生物活性腸道防御素的基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP7)基因敲除小鼠表現(xiàn)出清除腸道病原體的能力下降。與野生型小鼠相比，HD5轉(zhuǎn)基因小鼠的硬壁菌菌數(shù)減少，類小桿菌菌數(shù)增加，而MMP7缺陷小鼠則相反[24]。此外，HD5在小鼠中的過度表達導(dǎo)致遠端小腸中分節(jié)狀細菌顯著減少，固有層中T17細胞數(shù)也減少，這清楚地表明腸道HDPs代表了形成微生物群落的關(guān)鍵因素和消化道的炎癥狀態(tài)。

4 HDPs對動物生長性能和腸道形態(tài)的影響

多項研究強調(diào)了直接飼喂HDPs對豬生長、腸道形態(tài)和免疫狀態(tài)的有益作用。飼喂重組家蠶HDPs天蠶素A/D明顯提高了受ETEC侵襲的斷奶仔豬的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，并減少了腹瀉發(fā)生率，同時在6 d內(nèi)對腸道形態(tài)和氮/能量利用沒有產(chǎn)生顯著的影響[25]。飼糧中添加來源于牛乳鐵蛋白的重組融合HDPs也提高了仔豬的生長性能，并在21 d內(nèi)降低了受ETEC侵襲的仔豬的腹瀉發(fā)生率[26]。在5個不同的農(nóng)場中，飼喂4種重組HDPs的混合物，包括乳鐵蛋白、天蠶素、防御素和菌絲霉素，可增強斷奶仔豬的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，并減少了腹瀉發(fā)生率[27]。與上述研究相似，在4周的試驗中補充人工合成HDPs(AMP-A3或P5)改善了斷奶仔豬的營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道形態(tài)和生長性能，但沒有顯著影響血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量[28]。此外，AMP-A3和P5似乎降低了潛在有害梭菌的滴度以及回腸、盲腸和糞便中大腸菌群數(shù)量[29]。在受真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的侵襲下，飼喂2種HDPs和1種益生菌酵母的組合物使仔豬的腸道形態(tài)和飼料轉(zhuǎn)化率得到提升[30]。在上述大多數(shù)試驗中，HDPs在促進豬群生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和改善腸道形態(tài)方面與抗生素?zé)o差別。飼糧中補充AMP-A3增加了肉仔雞的體重，提高了飼料轉(zhuǎn)化率，這與飼糧中補充抗生素阿維菌素的肉仔雞的生產(chǎn)性能相近[31]。通過增加小腸絨毛高度和絨毛高度隱窩深度比例，肉雞的腸道形態(tài)也可得到改善。添加含重組天蠶素A/D的酵母肉湯提高了肉雞的腸道形態(tài)和飼料轉(zhuǎn)化率，在4周的試驗中有提高肉雞生長性能的趨勢[32]。天蠶素A/D也降低了42日齡雞的空腸和盲腸內(nèi)容物的總需氧菌數(shù)量。總的來說，這些動物試驗結(jié)果表明了HDPs飼喂動物的益處，證明了飼糧中補充HDPs作為促進動物生長和疾病控制的抗生素替代策略是合理的。

5 誘導(dǎo)HDPs合成的化合物

由于HDPs容易發(fā)生酶促降解并且合成或重組形式的生產(chǎn)成本高，因此在動物飼糧中直接補充HDPs可能不具有生物學(xué)有效性和經(jīng)濟效益。最近，已發(fā)現(xiàn)幾類小分子化合物如丁酸鹽可誘導(dǎo)HDPs合成，并增強動物體內(nèi)的細菌清除率，而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。飼糧補充這些簡單的HDPs誘導(dǎo)化合物或其組合被證明是一種替代低成本動物常用抗生素的新方法。飼料補充0.1%丁酸顯著增加雞腸道HDPs的表達，同時減少盲腸中近10倍試驗感染劑量的腸炎沙門氏菌的滴度[33]。在雞HD11巨噬細胞和初級單核細胞中，誘導(dǎo)合成的HDPs與游離的脂肪烴鏈長度呈負相關(guān)，短鏈脂肪酸是最有效的，中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸效果較差[34]。3種短鏈脂肪酸，即乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，在雞細胞中在增強HDPs基因表達方面發(fā)揮了強大的協(xié)同作用。與單獨添加短鏈脂肪酸相比，將3種短鏈脂肪酸組合混合添加到飲水中能進一步減少雞盲腸中的腸炎沙門氏菌感染。更重要的是，短鏈脂肪酸增強了HDPs基因的表達而不刺激促炎白細胞介素-1β的產(chǎn)生。丁酸鹽緩解了大腸桿菌O157∶H7誘導(dǎo)的豬溶血性尿毒癥的臨床癥狀綜合征(HUS)和部分炎癥，并且通過乙酰化修飾作用來上調(diào)HDPs的表達[35]。乙酸、丙酸、丁酸和己酸均能減少金黃色葡萄球菌感染牛乳腺上皮細胞并上調(diào)TAP、BNBD5基因表達[36]，但這些HDPs誘導(dǎo)化合物在促進動物生長、腸道健康和微生物群落平衡方面的功效尚需在反芻動物試驗中進一步得到證實。

6 小 結(jié)

破壞腸道屏障會導(dǎo)致動物疾病并降低生產(chǎn)效率，因此了解腸道屏障功能及其調(diào)控機制對于確保畜牧業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展至關(guān)重要。憑借強大的抗菌性和免疫調(diào)節(jié)能力，HDPs進一步表現(xiàn)出直接調(diào)節(jié)腸道屏障功能的新能力。HDPs異常合成通常導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，屏障完整性受損的疾病通常與HDPs合成減少有關(guān)，這均顯示出HDPs在增強腸道健康和動物表現(xiàn)方面的潛力。雖然已實現(xiàn)應(yīng)用合成肽治療人類疾病，但在畜牧業(yè)中應(yīng)用成本還是非常高昂的。HDPs的誘導(dǎo)化合物或外源性重組HDPs已經(jīng)成為動物疾病預(yù)防與治療的有效策略，并且在未來可能替代畜牧生產(chǎn)中抗生素的使用。