任世斌，趙 亮，郭抗抗，林 青

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度傳染性疾病，在亞洲、西歐、俄羅斯和南非等國家[1]都有報(bào)道。根據(jù)CSFV核酸序列可將其分為3個基因型，進(jìn)一步可分為11個亞型，而對于核酸的一些保守序列與病毒毒力是否有一定的關(guān)聯(lián)還有待研究。目前對于CSF的防控主要有疫苗手段和非疫苗手段。在中國，基于CSFV C株的弱毒疫苗廣泛用于豬群CSF的預(yù)防，因而在國內(nèi)很少有CSF大規(guī)模暴發(fā)的情況發(fā)生，但零星的感染還是不斷出現(xiàn)。對于已經(jīng)接種過疫苗的豬群，一些野生、非經(jīng)典型的豬瘟還是無法完全避免，仍舊會導(dǎo)致豬只的異常甚至死亡[2]，豬瘟的防控依然任重而道遠(yuǎn)。

1 豬瘟病毒的致病機(jī)理

CSFV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，是黃病毒科瘟病毒屬的成員。自然感染潛伏期為5 d～7 d，病程不一，短者2 d，最長可達(dá)21 d。CSFV可通過口腔和鼻腔黏膜進(jìn)入宿主細(xì)胞，感染扁桃體部位的細(xì)胞，進(jìn)而通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)傳播到全身。CSFV對免疫細(xì)胞具有一定的偏好性，使感染豬胸腺、脾、淋巴結(jié)及骨髓中的白細(xì)胞大量凋亡。

CSFV基因組由3部分組成，包括5′非編碼區(qū)(5'non-coding region，5′-NCR)、開放閱讀框(open reading frame，ORF)和3′-NCR。其中ORF編碼一個大的多聚前體蛋白，可被剪切為4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)、8個非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B),4種結(jié)構(gòu)蛋白組成了病毒粒子，其他非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮作用。

E1糖蛋白由195個氨基酸組成，大小約33 ku，含有3個N連接的糖基化位點(diǎn)和6個半胱氨酸殘基。E1屬I型跨膜蛋白，位于胞外的N端和疏水的C端使E1可以附著在病毒外被上，同源二聚體化后能夠介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞[3]。

E2也是一種糖蛋白，由373個氨基酸組成，大小約55 ku，含有6個N連接的糖基化位點(diǎn)，一個O連接的糖基化位點(diǎn)。N端的信號肽和C端的跨膜結(jié)構(gòu)域使E2可以錨定在病毒表面，并可通過二硫鍵形成同源二聚體。E2是CSFV糖蛋白中主要的免疫原性蛋白，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體，引發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

E2蛋白可與β肌動蛋白相互作用，影響CSFV的復(fù)制和侵染，E2蛋白糖基化雖不影響這一過程，但糖基化位點(diǎn)的異常可降低CSFV的免疫原性[4]。E2蛋白可與許多宿主細(xì)胞因子相互作用，影響CSFV黏附細(xì)胞的過程[5]，與之相關(guān)的宿主細(xì)胞因子已經(jīng)確定，但CSFV上的功能性受體還未知，有待進(jìn)一步研究。

Erns由227個氨基酸組成，大小為44 ku左右。Erns具有顯著的RNA酶活性，既可在胞外發(fā)揮功能，也可被內(nèi)吞入胞內(nèi)發(fā)揮作用。一方面，Erns能夠降解病毒的單鏈RNA，阻止病毒與pDC上的Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)相互作用，影響抗原的提呈，從而促進(jìn)病毒的增殖[6]。另一方面，Erns可與雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)結(jié)合，破壞TLR3的信號途徑，從而干擾抑制干擾素Ⅰ(interferon Ⅰ，IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生，阻礙宿主的早期免疫應(yīng)答。

C蛋白分子質(zhì)量約14.3 ku，含較多的堿性氨基酸，其N端被Npro、C端被宿主信號肽酶切割后，便從多聚蛋白體上釋放，除影響宿主基因的表達(dá)外，還可在病毒 RNA的復(fù)制過程中發(fā)揮作用[7-8]。此外，該蛋白的小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)化修飾也可介導(dǎo)病毒的復(fù)制和免疫逃逸。

非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein,NSP)與非編碼區(qū)(NCR)的相互作用在調(diào)節(jié)RNA復(fù)制和翻譯過程中發(fā)揮作用。NS3、NS4、NS4B、NS5A、NS5B對病毒基因組的復(fù)制都是必須的[9]。NS5A通過調(diào)節(jié)與NS5B和3′-NCR之間的作用來控制病毒RNA的合成。當(dāng)NS5A含量較低時，優(yōu)先與NS5B結(jié)合，促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制；但當(dāng)含量較高時，則會與3′-NTR作用，抑制病毒RNA的復(fù)制。因此，CSFV可能通過NS5A的表達(dá)來調(diào)節(jié)RNA復(fù)制。

NS5B是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，與3′-NTR上的同源序列相結(jié)合后起始翻譯過程。此外，NS5B與RNA的相互作用可增強(qiáng)NS5B N端RdRp活性。與細(xì)胞mRNA不同，CSFV基因組末端無5′帽子結(jié)構(gòu)，內(nèi)在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)位于5′-NCR，可被核糖體識別并起始翻譯過程。NS3可與IRES結(jié)合，促進(jìn)IRES介導(dǎo)的翻譯。與之相反的是NS5A能夠抑制這一翻譯過程，而NS5B可負(fù)調(diào)控與IRES結(jié)合的NS5A的功能。此外，NS5B還可刺激NS3，提高病毒基因組的翻譯效率。干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的Mx1蛋白能通過抑制NS5B來降低病毒感染[10]。

病毒進(jìn)化出多種策略逃避宿主固有免疫應(yīng)答，促進(jìn)自身的復(fù)制。CSFV Npro蛋白與IFN調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor-3，IRF-3)或IRF-7相互作用，能夠降低Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的表達(dá)水平，從而促進(jìn)病毒的感染。宿主細(xì)胞多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1(polycytosine binding protein 1，PCBP1)、血紅蛋白β亞基(HB)同樣能夠負(fù)調(diào)節(jié)IFN信號通路，促進(jìn)CSFV的增殖。研究表明，硫氧還原蛋白(thioredoxin，Trx)2與E2相互作用，可通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路抑制CSFV的復(fù)制，因而CSFV阻礙Trx2表達(dá)，干擾宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)[11]。另有發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)2與E2互作，可通過減弱c-Jun氨基端激酶(JAK)信號通路增強(qiáng)CSFV的復(fù)制[12]。

急性CSF通常引起發(fā)熱、白細(xì)胞增多、血小板減少和出血等。急性CSFV感染，會導(dǎo)致IFN-Ⅰ水平異常，釋放多種促炎性細(xì)胞因子。強(qiáng)烈的IFN-α應(yīng)答與淋巴細(xì)胞的耗損有著直接關(guān)系。此外，IL-1α、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)是引發(fā)血小板減少的主要細(xì)胞因子，CSFV感染還可誘導(dǎo)Fas等凋亡基因的表達(dá)。

病毒Npro和NS2都可抑制宿主細(xì)胞的凋亡。Npro是一種多功能的蛋白，能夠抑制雙鏈RNA誘導(dǎo)的凋亡，但對由CSFV的NCR誘導(dǎo)的凋亡沒有作用[13]。NS2的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞周期停留在間期(S期)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。CSFV引起的凋亡可能與大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生有著密切關(guān)系。

2 豬瘟診斷技術(shù)

對豬瘟的診斷方法有許多種，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體技術(shù)、兔體交互免疫試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、病毒分離鑒定等。其中，間接血凝試驗(yàn)操作簡單，能測出抗體水平高低，被檢血清在4log2以上者為免疫合格；免疫熒光試驗(yàn)也可檢測豬瘟病毒的分布，結(jié)果直觀，但檢測的靈敏度不高；兔體交互免疫試驗(yàn)準(zhǔn)確可靠，試驗(yàn)條件要求不高，但步驟復(fù)雜，所需的時間也比較長；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)無法定量動物體內(nèi)的感染量，且容易受到污染；病毒分離鑒定無法定量，且耗時很長。

2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR

RT-PCR基本可滿足實(shí)驗(yàn)室對CSFV和非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的檢測需求，但由于這兩種病毒在地理分布和引發(fā)臨床癥狀方面高度相似，該方法并不能對它們有效的進(jìn)行區(qū)分，易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將單核苷酸提取法與實(shí)時RT-PCR聯(lián)合使用，能夠有效分辨CSFV和ASFV，該試驗(yàn)不僅適用于常規(guī)豬病毒病的診斷，還能夠分別對CSFV和ASFV在4.9和22個拷貝量時進(jìn)行檢測，且其敏感性有保證，與多重TaqMan探針標(biāo)記的RT-PCR(RT-nPCR-TaqMan)相當(dāng)，對CSF的診斷特異性可達(dá)到100%，ASF則為97.3%，檢測的過程也更加標(biāo)準(zhǔn)化。能夠有效滿足臨近地域CSFV和ASFV快速鑒別診斷的技術(shù)需求[14]。

2.2 基于SYBR Green Ⅰ的實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)的發(fā)展使對RNA的檢測更加快速普遍，有效避免了常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增DNA時易于污染的缺點(diǎn)，能夠在DNA復(fù)制過程中監(jiān)測復(fù)制子的集聚情況，得到廣泛的應(yīng)用。但是此類方法大都使用TaqMan探針，因而無法實(shí)現(xiàn)連續(xù)的監(jiān)測。

基于核酸染料SYBR Green I的實(shí)時熒光定量RT-PCR有效的解決了這個問題。由于SYBR Green Ⅰ與核酸變性相關(guān)，故可導(dǎo)致熒光信號的減弱。因此，利用相關(guān)軟件對熒光信號的強(qiáng)弱變化進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)CSFV的持續(xù)監(jiān)測。且檢測的病毒cDNA拷貝數(shù)范圍較廣，每次反應(yīng)可檢測103～1011或102～1011的拷貝，敏感性和特異性都顯著優(yōu)于常規(guī)RT-PCR。基于SYBR Green Ⅰ的實(shí)時熒光定量PCR是一種省時、易于操作、敏感性強(qiáng)、特異性高、重復(fù)性好的檢測方法，是實(shí)現(xiàn)CSFV長期監(jiān)測的有力工具。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等報(bào)道，優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、節(jié)省時間，可用于CSFV的核酸檢測。相較于病毒分離和實(shí)時RT-PCR，LAMP法更適于實(shí)踐，因?yàn)樵摲椒o需昂貴設(shè)備支持，診檢測結(jié)果與濁度相關(guān)，用肉眼可直接觀測。該方法近幾年得到了極大地發(fā)展，LAMP的產(chǎn)物可用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、地高辛(digoxin，DIG)等小分子進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而用側(cè)向流動試紙的方法來實(shí)現(xiàn)分離。試紙上包被著能夠與小分子標(biāo)記物特異性反應(yīng)的抗體，當(dāng)兩者作用時，試紙上會出現(xiàn)彩色的陽性反應(yīng)條帶；聯(lián)合側(cè)向流動試紙的LAMP(LAMP-LFD)試驗(yàn)，更能夠滿足在野外或農(nóng)場快速診斷的需求[15]。該方法與反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合后，可實(shí)現(xiàn)CSFV RNA的檢測，敏感性與實(shí)時RT-PCR相同。

2.4 DNA芯片技術(shù)

DNA芯片是將特定的DNA通過共價或非共價的方式固定在某一載體表面，利用核酸雜交而實(shí)現(xiàn)檢測的目的。其能夠在短時間內(nèi)讀取大量的信息，操作便捷，多用于病毒的鑒定，如CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)和流感病毒等[16]。DNA芯片極少出現(xiàn)非特異性的相互作用，從而減少了非靶向擴(kuò)增的RNA，大大提高了特異性。但由于表面高密度固定探針的隨機(jī)排列，該方法診斷的敏感性和有效性較低[17]。

當(dāng)DNA芯片上添加9個連續(xù)的腺嘌呤(9A)時，熒光強(qiáng)度可達(dá)到最大?；谶@些發(fā)現(xiàn)，新型的CSFV DNA芯片添加了9個腺嘌呤，這些分子在固定的探針之間產(chǎn)生一定的側(cè)向間距，提高了探針的可接近性，使靶向特異性雜交的特異性和敏感性達(dá)到100%。經(jīng)CSFV DNA芯片鑒定的基因型與核酸序列分析的結(jié)果一致性高。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

目前已有多種類型的ELISA方法用于CSFV的檢測，其中一些也已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，如間接ELISA。用全病毒作為抗原的捕獲ELISA和競爭ELISA(competitive ELISA，C-ELISA)等。間接ELISA通過建立對CSFV 血清抗體的檢測方法對臨床的E2蛋白多個抗原表位進(jìn)行檢測，應(yīng)用廣泛。Lorena等發(fā)現(xiàn)，ELISA可在感染后13 d內(nèi)檢測出患病豬只血液或脾臟樣品中是否含有CSFV(C株)疫苗毒，RT-PCR則需要至少在感染后16 d才能確定。

C-ELISA是基于CSFV E2重組蛋白，通過抗原抗體相互作用實(shí)現(xiàn)。C-ELISA的敏感性97%，特異性100%。中和過氧化物酶聯(lián)試驗(yàn)(neutralization peroxidase chain test，NPLA)曾作為衡量C-ELISA檢測水平高低的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其敏感性與噬斑試驗(yàn)相當(dāng)?？蓪s70%～80%感染CSFV 3周的豬群體內(nèi)的抗體進(jìn)行檢測。試驗(yàn)證明C-ELISA的敏感性和特異性與上述幾種方法差異不大。C-ELISA與NPLA的相對特異性和靈敏度分別可達(dá)100%和86%，表現(xiàn)出NPLA和C-ELISA之間極好的相關(guān)關(guān)系。雖然C-ELISA敏感性不如NPLA，但增加樣品數(shù)量可以解決這一問題。C-ELISA是CSFV大規(guī)模篩查的有力工具。

由于CSFV在基因構(gòu)成和結(jié)構(gòu)上與牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)相似，也有用BVDV的E2蛋白研制CSFV ELISA檢測方法的報(bào)道[18]，敏感性和特異性都較高，可以作為一種低成本大規(guī)模檢測的方法。

豬瘟病毒也可在患病動物的唾液-鼻液等分泌液中檢出。Dietze K等[19]開發(fā)出的利用棉繩對豬群體唾液采樣作為病毒早期檢測技術(shù)，在其試驗(yàn)研究中收到了良好的效果。所有的測試動物都能在感染后7 d～15 d內(nèi)從唾液中檢測出CSFV的核酸?？紤]到養(yǎng)豬業(yè)的不斷規(guī)模化、集群化發(fā)展，這種群體規(guī)模的簡易快捷方法可能會成為未來的重要檢測方法。

其他方面的研究也可以提供診斷研究參考，如納米DNA探針檢測PCV技術(shù)。其試驗(yàn)展現(xiàn)出DNA探針比常規(guī)PCR和實(shí)時PCR更好的效果，對潛伏期的病例也能有效的進(jìn)行檢測，并且沒有抗體檢測方法中會出現(xiàn)的假陽性的情況[20]。隨著更加高效便捷的基于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的反向遺傳方法獲得cDNA的技術(shù)的出現(xiàn)[21]。

3 豬瘟的防控

3.1 傳統(tǒng)兔化弱毒疫苗

第1代抗CSF的疫苗是在1936年利用病毒和豬高免血清混合制備的，但其安全性低且僅可用于初次免疫。目前最常用的疫苗皆由C毒株衍生而來，C株兔化弱毒疫苗具有顯著的效力，單次接種4 d就可提供有效的保護(hù)，連續(xù)的口服免疫也可使機(jī)體對CSFV具備半年甚至終身的抵抗力，并且這些用于免疫的毒株對所有物種都是安全的。采用C毒株疫苗免疫的豬體內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)3(complementarity determining region 3，CDR3)譜型呈現(xiàn)出動態(tài)變化，且T細(xì)胞受體(T cell receptors，TCRs)AV5S/8-3S/8-4S/14/38 and BV4S/6S/7S/15S/30基因家族的克隆也得到增強(qiáng)[22]。C毒株疫苗可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞應(yīng)答，從而產(chǎn)生特異性抗體。疫苗毒株的復(fù)制速度非常低,注入后使機(jī)體對TLR的表達(dá)調(diào)控失常，過表達(dá)的TLR引發(fā)固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)用以清除疫苗。同時，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的白介素誘導(dǎo)B細(xì)胞的分化和特異性抗體的產(chǎn)生[23]。這類疫苗除了缺少表型DIVA區(qū)別(differentiation of infected from vaccinated animals)的標(biāo)志，幾乎滿足了完美疫苗的所有要求。

傳統(tǒng)疫苗可以作為衡量免疫效力的標(biāo)準(zhǔn)，但只有具備DIVA的新型疫苗才能為改進(jìn)消除病毒的策略提高參考。就CSFV疫苗而言，不同的免疫方案需要的疫苗也有所差異。理想的疫苗不但要具備DIVA，還要有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，易于生產(chǎn)，低消耗，能夠引發(fā)強(qiáng)烈甚至終身的免疫，且對接種動物來說沒有副作用。

3.2 生物技術(shù)疫苗

3.2.1 DNA疫苗 目前DNA疫苗的雛形都是基于構(gòu)建表達(dá)CSFV E2糖蛋白的質(zhì)粒。其標(biāo)記性仍舊依據(jù)Erns或NS3特異性抗體的檢測。有時可共表達(dá)一些編碼細(xì)胞因子(如IL-3、IL-12和IL-18)或調(diào)節(jié)性細(xì)胞表面分子CD154的基因，用于提高其免疫原性。研究表明，CD81可增強(qiáng)其免疫應(yīng)答[24]。然而,為了保護(hù)豬群抵御強(qiáng)毒株的入侵，較高的使用劑量和多樣化的免疫方案仍舊不可或缺。總而言之，DNA疫苗的高制備消耗和低傳送效率，使得這一方法對免疫豬群來說不夠經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

3.2.2 病毒載體疫苗 自20世紀(jì)90年代以來，病毒載體疫苗的研究常用牛痘病毒和偽狂犬病病毒。此外，還有豬和人的腺病毒載體，豬痘病毒載體，副痘病毒載體以及禽痘病毒載體等多種其他的病毒載體系統(tǒng)可供選擇。禽痘病毒屬的病毒只能在禽類體內(nèi)有效復(fù)制，因而不能有效感染脊椎動物。多數(shù)情況下，病毒載體表達(dá)CSFV E2蛋白。E2糖蛋白或Erns重組牛痘病毒疫苗能夠?qū)χ旅腥玖康腃SFV提供保護(hù)，不過需要靜脈注射高滴度的疫苗。對腺病毒載體疫苗的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用含有CSFV E2基因的裸DNA和重組豬腺病毒分別進(jìn)行初級免疫和次級免疫，都能夠有效誘導(dǎo)已經(jīng)斷奶的豬群產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，而對處于斷奶期前的豬群則只能使約75%得到保護(hù)[25]。

Li J L等發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)小腸結(jié)核耶爾森氏菌侵襲素的C端結(jié)構(gòu)域能夠有效加強(qiáng)腺病毒載體CSFV疫苗的效果。目前，一種新型的二價偽狂犬病病毒/CSFV標(biāo)記疫苗已經(jīng)研發(fā)，利用偽狂犬病病毒的突變體作為載體與CSFV E2制備的重組疫苗，能夠同時預(yù)防偽狂犬病和CSF[26]。另一種HAdV-5(rAdV-E0-E2-IL2)的重組人腺病毒疫苗，可表達(dá)CSFV E2、CSFV Erns和IL2，兩次高滴度間隔3周的肌肉內(nèi)注射能夠確保個體不受CSFV強(qiáng)毒株的傷害[27]。

此外，也可用CSFV疫苗做載體，導(dǎo)入其他病毒的序列。如將豬圓環(huán)病毒2型的Cap基因?qū)虢?jīng)典的C株疫苗中，來預(yù)防豬瘟病毒與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染。但試驗(yàn)中并沒有成功誘導(dǎo)產(chǎn)生對Cap的抗體，僅有對豬瘟部分的保護(hù)相對完善[28]。

上述提到的部分疫苗能夠提供完全保護(hù)，然而有些疫苗可靠的免疫試驗(yàn)數(shù)據(jù)仍舊較為缺乏，尤其是在機(jī)體對于病毒載體的免疫應(yīng)答方面。特定載體的使用可能會干擾血清監(jiān)測系統(tǒng)，如偽狂犬病病毒載體的使用會導(dǎo)致偽狂犬病病毒逃逸監(jiān)視。

3.2.3 基于蛋白質(zhì)和肽的疫苗 E2亞單位疫苗是研發(fā)出的第一種具備DIVA的疫苗。純化的CSFV E2糖蛋白能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。這類亞單位疫苗含有重組CSFV E2，由桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所得。在進(jìn)行ELISA鑒定時，受野生型病毒感染的動物可與針對Erns的特異性抗體呈陽性反應(yīng)，而免疫過的動物僅與針對E2的特異性抗體反應(yīng)。

E2亞單位疫苗的安全性得到了證實(shí)(或稱在某些情況下有輕微的局部反應(yīng))，但由于攻毒和免疫研究結(jié)果不穩(wěn)定，它的效力無法與C-株疫苗或其他減毒活疫苗相類比。為了確保產(chǎn)生抗CSFV橫向和縱向感染的有效免疫應(yīng)答，需要不經(jīng)腸的免疫途徑，且疫苗的劑量要加倍，這也意味著該類疫苗無法口服?，F(xiàn)在只有一種含油包水佐劑的CSFV E2糖蛋白亞單位疫苗在歐洲市場上市[29]。

近年來，使用多種表達(dá)載體來增強(qiáng)E2亞單位疫苗效果的研究越來越多，如經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以獲得包含E2糖蛋白胞外結(jié)構(gòu)域，并且?guī)в薪M氨酸標(biāo)簽的疫苗。該表達(dá)系統(tǒng)最大的優(yōu)勢在于保持了E2糖蛋白完整的四級結(jié)構(gòu)。有報(bào)道稱，這一疫苗能夠在CSFV感染早期，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長期有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，與此同時，共表達(dá)人的α干擾素可增強(qiáng)其免疫原性。酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的E2蛋白，在兩次接種后同樣能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，且具備基于Erns特異性抗體的DIVA。目前已有能夠穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞系，如腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的E2蛋白，在聯(lián)合佐劑進(jìn)行免疫后，可引起強(qiáng)的抗CSFV應(yīng)答[30]。

除了E2亞單位疫苗以外，覆蓋CSFV E2糖蛋白不同區(qū)域的單肽或多肽疫苗也成為了研究的熱點(diǎn)。與亞單位疫苗相同，肽疫苗因?yàn)椴缓锌蓮?fù)制性的病毒而具備較高的安全性，但其需要與佐劑連用，并經(jīng)腸胃才可發(fā)揮免疫效應(yīng)。多數(shù)研究表明，大部分情況下，合成肽能夠引起一定水平的中和抗體的產(chǎn)生，卻無法形成對臨床疾病、毒血癥和排毒的完全保護(hù)。肽疫苗均不能引發(fā)抗CSFV感染的完全保護(hù)，即便是串聯(lián)重復(fù)的多表位疫苗也僅能確保部分保護(hù)，且其制備難度要大于E2亞單位疫苗。

其他蛋白能否用于亞單位疫苗的制備仍在研究，如重組NS3蛋白雖然能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特定的免疫應(yīng)答，但對于嚴(yán)重的感染卻沒有保護(hù)作用。

3.3 免疫防控

豬瘟病毒的免疫主要由CD8+T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。在Giulia的蛋白質(zhì)組掃描試驗(yàn)中，所有接種動物在5 d～28 d后都得到了保護(hù)，沒有出現(xiàn)白細(xì)胞減少或其他癥狀；接種疫苗的豬只都表現(xiàn)出CD4-CD8+和CD4+記憶細(xì)胞的激活狀態(tài)，并且均有γ干擾素分泌增加的現(xiàn)象[31]。雖然每一個個體的狀況各不相同，但其免疫過程卻都類似。

不僅是IFN-γ，IFN-α也能對CSFV起到抗病毒效果。相較于長期持續(xù)性的IFN-α反應(yīng)，短期的IFN-α反應(yīng)更有利于CSFV的免疫。Fernandez-Sainz I等[32]對IFN-α對抗CSFV的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的胎豬腎細(xì)胞(fetal porcine kidney,EPK)表現(xiàn)出了對CSFV的抗病毒活性，并且會因IFN-α的亞型不同而產(chǎn)生較大范圍的差別。

目前常用的聯(lián)合免疫有“332法”和“321法”?！?32法”即先用FMD和CSF疫苗同時在頸部分兩側(cè)注射，間隔14 d后再用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)疫苗注射?！?21法”即將CSF和HP-PRRS疫苗混合后作一針在頸部一側(cè)注射，F(xiàn)MD疫苗作一針在頸部另一側(cè)注射。有研究顯示，相比之下“321法”HP-PRRS免疫密度、散養(yǎng)豬CSFV和HP-PRRSV抗體陽性率、屠宰豬HP-PRRSV抗體陽性率均顯著增加，散養(yǎng)豬死淘率、HP-PRRS陽性率均顯著下降，而其他主要考核指標(biāo)則差異不顯著[33]。這一結(jié)果表明，應(yīng)用“321法”免疫程序的免疫效果優(yōu)于“332法”。

有研究指出，因?yàn)殚L期使用基因1型的疫苗，現(xiàn)在CSFV的流行株基因型逐漸向突變體和基因2型轉(zhuǎn)變[34-35]，這種作為一種野毒在人為選擇過程中的進(jìn)化結(jié)果，也是免疫失敗出現(xiàn)的原因之一，而免疫失敗后暴發(fā)的CSF促進(jìn)了宿主動物體內(nèi)CSFV的進(jìn)化。盡管調(diào)查的數(shù)據(jù)可能存在一些問題，而使得結(jié)果有爭議[36]，這種風(fēng)險(xiǎn)在長期使用相對單一基因型的疫苗情況下是確實(shí)存在的，因而其免疫與防控可能面臨新的挑戰(zhàn)。

4 展望

豬瘟因其傳染性、接觸性及高度的致病性和致死性，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對于豬瘟的研究，多側(cè)重于診斷技術(shù)，而致病機(jī)理方面則相對薄弱，豬瘟病毒的組成、如何感染細(xì)胞、信號通路的變化都還認(rèn)知有限，而其很高的變異性更是加大了防控的難度。因此，深入研究其分子構(gòu)成，確定影響其毒力的關(guān)鍵因子，對于研發(fā)高效、持久、多樣的新型疫苗，如表位疫苗、亞單位疫苗等，促進(jìn)豬瘟的防控有著重要意義。