石程仁，禹山林，杜秉海，楊 珍，陳 娜，潘麗娟，王 通，王 冕，遲曉元 ，陳明娜,*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2. 山東農業(yè)大學，山東 泰安 271000)

花生是我國重要的油料和經濟作物，多種植于丘陵、旱薄地，據(jù)統(tǒng)計2016年我國花生種植面積472.67萬公頃，占油料作物宗面積的33.43%[1-2]。由于我國花生產區(qū)相對集中，加上種植效益和環(huán)境條件等各方面因素的影響，花生連作現(xiàn)象普遍，山東、河南等主產區(qū)常多年連片、大規(guī)模種植，有的甚至連作了10～20年[1]。連作使花生病蟲害加劇，品質下降，連作 2～3 年，莢果平均減產19.8%～33.4%[3-4]。連作障礙已成為當前我國花生生產面臨的突出問題之一。研究發(fā)現(xiàn)，造成連作障礙的因素主要包括土壤營養(yǎng)元素失衡，作物根系分泌物、腐解物等化感物質的自毒作用，土壤微生物區(qū)系失衡，土壤酶活性改變等方面，歸結起來就是根際微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生改變[5]。

作物對營養(yǎng)物的吸收具有偏好性，同樣花生對土壤中營養(yǎng)元素也有特定的需求種類和吸收比例，長期單一種植必然會使土壤中營養(yǎng)元素失衡[5]。封海勝等[6]曾報道，中等肥力砂壤土花生連作三年后，土壤中速效磷、速效鉀和速效硼的含量較輪作土壤中分別減少了52.9%、40.6%和53.8%，水解氮含量變化不大?；ㄉL期連作使得從土壤中吸收的氮素較少，氮肥利用率和產投比降低；而對磷、鉀、硼、鐵、鈣等元素的吸收量較多[7-8]，導致土壤中營養(yǎng)元素失衡，花生的生長發(fā)育就會受到影響，抗逆能力降低，從而使其產量和品質下降。

根際微生態(tài)系統(tǒng)是一個以植物為主體，以植物—土壤—微生物及其環(huán)境條件相互作用過程為主要內容的有機系統(tǒng)[3]。植物、土壤、微生物的相互關系維系著根際微生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能。微生物是根際微生態(tài)系統(tǒng)的關鍵因子，在土壤物質循環(huán)中起重要作用，植物—土壤之間的相互作用一般會通過土壤微生物進行調節(jié)[9]。微生物的生長代謝不僅與花生的生長、發(fā)育密切相關，而且能敏銳反映土壤微環(huán)境的變化[10-11]。因此，本研究通過分析花生連作過程中根系土壤營養(yǎng)元素的變化特征及其與花生根系微生物群落結構的相關性，可以有效闡明花生連作過程中根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的變化情況，對了解連作花生土壤微生態(tài)系統(tǒng)各因子之間的相互關系具有十分重要的意義，為進一步探究花生連作障礙的關鍵因子以及達到從根本上緩解花生連作障礙的目標打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用盆栽試驗，供試花生品種分別為魯花12號和花育25號，土壤采自青島市近十年未種植過花生的耕層土，過1 cm篩后混勻，選用高26 cm，內徑36 cm的盆進行試驗，每盆裝土18 kg。每盆栽植2株，每個品種栽植20盆，連續(xù)種植三年。盆栽試驗采用旱棚模式：整個種植過程中不施加任何肥料；澆水則完全用滅菌水澆灌；取樣深度為表層以下5～10 cm處?；ㄉ磕?月上旬種植，生育期130 d。每年收獲期，每個花生品種隨機選擇10盆，用直徑1.5 cm土鉆于表層以下5～10 cm根部處取土樣混勻，具體取樣方法參見Mingna Chen等[12]，采集的土壤樣品于-80 ℃冰箱備用。

1.2 土壤元素的測定與分析

兩個花生品種連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別命名為L12-1、H25-1、L12-2、H25-2、L12-3和H25-3，例如L12-1為魯花12連作一年的土壤，H25-1為花育25號連作一年的土壤。土壤樣品剔除其中的花生根系及殘體等雜物，經自然風干，研磨過篩備用。土壤pH值用水浸提電位法測定(水土比5:1)，pH計為HI2221型，有機質用重鉻酸鉀容量法測定，水解氮用堿解擴散法測定，速效磷用NaHCO3浸提—鉬藍比色法測定，速效鉀用乙酸銨浸提火焰光度法測定，全鹽量采用殘渣質量烘干法測定，有效硼、有效鐵、有效錳、有效銅、有效鋅、有效鉬采用ICP-OES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀法測定[13-14]。

1.3 土壤微生物的群落結構分析

采用16S rRNA和18S rRNA基因文庫構建的方法對土壤中的細菌和真菌微生物群落結構進行分析[12,15]。針對兩個不同花生品種連作一年、兩年、三年收獲期的根系土壤分別構建了6個16S rRNA基因文庫(命名為L12-B1、H25-B1、L12-B2、H25-B2、L12-B3和H25-B3)和6個18S rRNA基因文庫(命名為L12-E1、H25-E1、L12-E2、H25-E2、L12-E3和H25-E3)。例如：L12-B1為魯花12號連作一年土壤的細菌文庫，L12-E1為魯花12號連作1年的真菌文庫。文庫構建后對所有測序序列的處理如Mingna Chen 等所述[13,15-16]。采用SPSS 18.0和Genesis program 1.7軟件對16S rRNA基因文庫和18S rRNA基因文庫的分類單元分別進行聚類分析和熱圖(heatmap)分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件對連作三年花生根系土壤的pH值及營養(yǎng)元素數(shù)據(jù)進行聚類分析及方差分析。用雙因素方差分析(two-way ANOVA)檢驗不同連作年限和不同花生品種根系土壤理化性質的差異。使用R語言的Vegan軟件包分析不同連作年限花生根系土壤微生物群落結構的相似性和差異性及其與土壤理化因子之間的相互關系。

2 結果與分析

2.1 連作花生土壤理化性質的變化特征分析

聚類分析表明，6個花生連作土壤樣品的理化性質可以分為三簇，連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別被歸為一類，其中連作兩年和連作三年的土壤理化性質分類更為接近 (圖1)。

進一步對不同連作年限花生根系土壤的pH和土壤元素含量進行分析，結果表明，連作確實對土壤理化性質影響顯著，但土壤pH及不同元素對連作的響應存在差異(圖2)；部分土壤理化性質也受花生品種的影響(表1)。土壤pH和有效磷、全鹽、有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅含量受連作年限影響顯著，連作兩年后指標變化尤其顯著。魯花12和花育25連作1年、2年、3年土壤pH分別是7.20、7.60、7.49 和7.21、7.62和7.54，連作兩年比連作一年的pH有較大幅度提高，第三年的pH值又略有降低，兩個品種表現(xiàn)一致。土壤中有效磷和全鹽含量則隨著連作年限的增加顯著降低，連作兩年的降低幅度尤為顯著。兩個品種三年連作土壤的有效磷含量分別為79.1、49.17、45.90和75.57、55.93、47.27(mg/kg)；全鹽量分別為1.55、0.75、0.23和1.24、0.45、0.24(g/kg)?；ㄉB作一年根系土壤有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量與連作兩年、三年土壤中的含量差異顯著，而連作兩年和連作三年土壤中的含量則差異不大(圖2)。另外，兩個品種根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全鹽量差異顯著，其他土壤理化指標品種間沒有顯著差異 (表1)。

圖1 花生連作土壤理化性質聚類分析 Fig.1 Clustering analysis of physical and chemical properties of peanut continuous cropping soil

測定項目Items for testing平方和 Sum of squares均 方 Mean squareF 值F value p值 p value pH 0.0020 0.0020 0.1300 0.7249 有機質Organic matter0.0021 0.0021 0.00000.9848水解氮 Hydrolyzable nitrogen 12.4991 12.4991 12.8260 0.0038??有效磷 Available phosphorus11.0450 11.0450 10.4140 0.0073??有效鉀 Available potassium15.4933 15.4933 0.35500.6117全鹽量 Total salt content0.1740 0.1740 114.3370 0.0001??有效錳 Available manganese0.1605 0.1605 0.49000.4974有效鉬 Available molybdenum0.0042 0.0042 2.83500.1180有效硼 Available boron0.0168 0.0168 21.45400.0006??有效鐵 Available iron0.0090 0.0090 0.00700.9394 有效銅 Available copper0.0038 0.0038 1.49200.2453 有效鋅 Available zinc0.0004 0.0004 0.10800.7485

注：**p<0.01。

圖2 不同連作年限花生根系土壤pH值及營養(yǎng)元素含量 Fig.2 The pH value and element concentrations of peanut root soil under different continuous cropping period 注：圖中不同大寫字母表示不同連作年限土壤pH值和元素含量顯著差異程度(p<0.01)；圖中數(shù)據(jù)為平均值± 標準誤差(n=3)。 Note: The different capital letters in the figure indicate the significant difference between soil pH and element content in different continuous cropping years (p<0.01); the data in the figure are mean ± standard error (n=3).

圖3 16S rRNA基因文庫OTUs的聚類分析 Fig.3 Clustering analysis of OTUs detected from 16S rRNA gene libraries

2.2 連作花生土壤微生物的群落結構及與土壤環(huán)境因子的相關性分析

對6個土壤樣品16S rRNA基因文庫和6個樣本的18S rRNA基因文庫的分類單元分別進行了聚類分析和熱圖分析。結果表明，花生連作對根系土壤微生物群落結構存在顯著影響，6個細菌文庫和6個真菌文庫的聚類結果一致，連作一年、兩年、三年的土壤微生物文庫分別被聚為一類，連作兩年與連作三年的土壤文庫聚類距離更為接近。表明花生根系土壤微生物群落結構確實受連作影響，而且對不同連作年限的響應存在差異，受花生品種影響較小。對比連作花生根系土壤細菌、真菌群落的聚類分析和土壤理化指標的聚類分析結果，發(fā)現(xiàn)聚類規(guī)律一致，即無論是不同花生品種微生物群落的聚類還是土壤理化指標的聚類，都是連作相同年限的土壤各聚為一類，且連作兩年與連作三年的土壤聚類距離更接近(圖1、圖3、圖4)。

圖4 18S rRNA基因文庫真菌類群的熱圖分析 Fig.4 Heatmap analysis of the fungal orders or phylotypes detected in the 18S rRNA gene libraries

圖5 土壤微生物群落與土壤元素的關聯(lián)分析 Fig.5 Correlation analyses on soil microbial communities and soil elements 注：Y1，Y2，Y3分別代表連作1年、2年、3年，A為土壤元素與16S rRNA基因文庫的聯(lián)合分析，B為土壤元素與18S rRNA基因文庫的聯(lián)合分析。Note: Y1, Y2, and Y3 represent continuous cropping for 1 year, 2 years, and 3 years, respectively. A is a collection analysis of soil elements and 16S rRNA gene library sequences, and B is a collection analysis of soil elements and 18S rRNA gene library sequences.

另外，選取受連作影響顯著的全鹽和四種土壤營養(yǎng)元素(有效磷、有效鉀、有效錳和有效銅)與連作過程中的土壤細菌群落和真菌群落分別進行典型相關分析(Canonical Correlation Analyses，CCA)結果表明，連作一年、兩年、三年的根系土壤微生物群落分別被歸為一類，全鹽量和有效銅的含量與連作兩年、三年土壤的微生物群落結構相關性強，而有效鉀、有效磷、有效錳的含量與連作一年的土壤微生物群落結構相關性強(圖5)。

3 討論與結論

花生根系土壤的理化性質受連作年限影響。黃玉茜[7]發(fā)現(xiàn)土壤中全氮含量、堿解氮含量隨著花生連作年限的增加總體呈先增后降再增的趨勢，而全磷、有效鉀含量則伴隨連作呈下降趨勢，有效 Fe、Cu、Zn的含量均隨連作呈逐年下降的趨勢。封海勝等[6]對中等肥力砂壤土連作花生的研究表明，土壤中速效磷、速效鉀和速效硼的含量隨連作年限的增加而減少，土壤中三者的含量在連作三年的土壤中較輪作土壤中分別減少了52.9%、40.6%和53.8%，而水解氮含量變化不大。本文對兩個不同花生品種連作一年、兩年、三年的土壤pH值以及11個常量、微量營養(yǎng)元素含量進行分析，聚類分析結果表明連作一年、兩年、三年的土壤樣品分別被歸為一類，其中連作兩年和連作三年的土壤理化性質更為接近。三年連作過程中，pH值先有較大幅度升高而后略有降低，全鹽量以及有效磷、有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量受連作影響顯著，其中全鹽量和有效磷含量隨連作年限增加而逐年降低，連作兩年土壤中的有效鉀、有效錳、有效鐵、有效銅的含量比連作一年的土壤顯著降低，而與連作三年土壤中的含量差異不大。另外，根系土壤的水解氮、有效磷、有效硼含量和全鹽量還受品種影響顯著。

綜上所述，連作確實造成花生根系土壤營養(yǎng)元素失衡，長期連作和短期連作對花生根系土壤pH值及元素含量的影響效力不同，并且不同理化指標對連作年限以及品種的響應也有所差異。

對兩個花生品種連作一年、兩年、三年的根系土壤微生物群落結構的分析結果表明，連作對土壤微生物群落的影響規(guī)律與對土壤理化性質的影響規(guī)律一致，連作一年、兩年、三年的花生根系土壤微生物群落存在顯著差異，并且，連作兩年與連作三年的土壤微生物群落結構更為相似。近年來，對連作花生土壤微生物群落結構的研究越來越多，研究證實連作確實造成花生根系土壤微生物群落結構失衡，土壤及根際真菌的數(shù)量隨花生連作年限的增加而顯著增加，細菌和放線菌數(shù)量則明顯減少[16-17]。我們前期對花生連作過程中土壤微生物群落演替規(guī)律的研究結果也表明花生連作致使土壤微生物群落結構失衡，病原微生物尤其是真菌性病原菌的豐度和多樣性增加，而有益微生物則呈減少趨勢[12,15]。但目前，對花生連作過程中根系土壤微生物群落結構和土壤理化性質之間的相關性研究還很少。本研究證實花生連作過程中根系土壤微生物群落結構的變化確實與土壤理化性質的變化存在密切相關性，并且兩者變化趨勢對連作年限的響應一致。對連作過程中含量變化顯著的土壤元素進一步與土壤細菌、真菌群落結構進行關聯(lián)分析，結果表明全鹽量和有效銅的含量與連作兩年、三年土壤的微生物群落結構相關性強，而有效鉀、有效磷、有效錳的含量與連作一年的土壤微生物群落結構相關性強，推測這些元素與土壤微生物的生長代謝密切相關，由于花生對營養(yǎng)元素的偏好性，使連作過程中土壤營養(yǎng)元素失衡，進而影響了根系微生物的生長代謝，從而使根系微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，進而導致花生的生長發(fā)育受到影響。

本研究分析了花生連作過程中土壤理化性質包括pH值和土壤常量、微量元素的變化特征和連作過程中花生根系土壤微生物群落結構變化特征及其與土壤理化性質之間的相關性。結果表明，花生根系土壤理化性質和土壤微生物群落結構確實受連作影響，而受花生品種影響較小。兩者對連作年限的響應規(guī)律一致，連作一年的土壤與連作兩年、三年的土壤差異更為顯著；并且連作過程中根系土壤理化性質的變化與土壤微生物群落結構的變化具有顯著相關性。