徐 赫，潘麗娟，陳 娜，陳明娜，王 冕，王 通，禹山林，梁成偉，遲曉元*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266042； 2.山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，是重要的植物油脂和蛋白質(zhì)來源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)中的地位日益顯著[1-2]?；ㄉ械娜８视?triacylgycerol，TAG)主要由兩條途徑合成，其中一條便是PDAT途徑。二酰甘油(diacylglycerol, DAG)在磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase，PDAT)的催化條件下與磷脂(phospholipids, PC)反應(yīng)生成TAG和溶血磷脂(lyso-phospholipids, LPC)[3-5]。

PDAT基因已經(jīng)在擬南芥[6]、水稻[7-8]、玉米[9]、亞麻、花生[10-11]等植物中被克隆出來。然而PDAT在不同物種中的功能存在差異性。Pan[12]等從亞麻的種子中克隆出一組PDAT基因，在酵母和擬南芥中高度表達(dá)，可使其中的亞麻酸成分快速升高。在綠色衣藻中，其PDAT擁有?；D(zhuǎn)移酶及脂肪酶的兩種活性，體內(nèi)膜脂分解的過程中，伴隨TAG的產(chǎn)生，在各種脅迫條件下得以更好地生存[13]。

為探索PDAT蛋白在花生油脂合成與表達(dá)的意義，本文克隆得到2個蛋白的完整基因，分別命名為AhPDAT1和AhPDAT2。其基因登錄號分別為KJ704777，MH790267。

1 材料與方法

1.1 植物材料

山東省花生研究所提供的花育33號。花生生長到三葉期后進(jìn)行幾種激素與非生物脅迫處理。具體參照郝翠翠等[14]的方法。

1.2 總RNA提取與cDNA合成、目的基因的擴(kuò)增

擬南芥兩個蛋白序列是從NCBI上搜索到的，分別是AtPDAT1(AT5G13640)和AtPDAT2(AT3G44830)。從花生cDNA文庫里發(fā)現(xiàn)了2個編碼磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的基因的全長序列：AhPDAT1和AhPDAT2。根據(jù)上述序列，設(shè)計出基因的完整引物。引物序列AhPDAT1-F：5’-ATGTCGTTTCTGCGCCGC-3’；AhPDAT1-R：5’-CTAGAGCTTTAAATTAATATTTTC-3’；AhPDAT2-F：5’-ATGTCTTCAGTTCGACGGAG-3’；AhPDAT2-R：5’-TCACAGGCGTAACTTAATTTTC-3’。具體參照陳娜等[15-16]的方法。模板采用cDNA，通過PCR擴(kuò)增得到目的基因，具體參照郝翠翠等[14]的方法。

1.3 氨基酸序列分析

蛋白質(zhì)的基本參數(shù)-ProtParam；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)-TMHMM 2.0 Server；蛋白的二級結(jié)構(gòu)-SCRATCH Protein Predicter Tool。

1.4 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

研究PDAT所存在的進(jìn)化關(guān)系，建立一個多基因組的數(shù)據(jù)庫。這12個基因組分別為：擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組，花生野生種(Arachisduranensis)基因組，花生野生種(Arachisipaensis)基因組，花生栽培種(Arachishypogaeacv. Tifrunner)基因組，大豆(Glycinemax)基因組，水稻(Oryzasativa)基因組，短柄草(Brachypodiumdistachyon)基因組，狗尾草(Setariaitalica)基因組，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)基因組，江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)基因組，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和團(tuán)藻(Volvoxcarteri)基因組數(shù)據(jù)?；蚪M數(shù)據(jù)從peanutbase數(shù)據(jù)庫下載獲得。設(shè)定E值<1e-10[17]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA 6.0軟件的Neighbour-Joining法。

1.5 熒光定量PCR

PCR反應(yīng)按陳娜等[15-16]的方法。采用Actin11為內(nèi)參基因，實驗數(shù)據(jù)使用2-△△Cp方法來分析[18]。熒光定量的引物：

qAhPDAT1-F：5’- GAGAAGGAGAAGGAGGAGGAAGAG -3’,

qAhPDAT1-R：5’- ACCACCAGAGGGAGCATATCAC-3’；

qAhPDAT2-F：5’- GCCGAAGAGAACAACAAAGAAGAAG -3’,

qAhPDAT2-R：5’-AGAACAGCATCAACCACCACAC -3’；

qACT11-F：5’- TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC -3’；

qACT11-R：5’- AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC -3’。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhPDAT1和AhPDAT2基因的克隆

編碼磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的基因的完整序列是從花生cDNA文庫中克隆獲得的，它們與擬南芥AtPDAT1和AtPDAT2基因序列相似性很高。其中，AhPDAT1基因全長2103 bp，編碼700個氨基酸；AhPDAT2基因全長2046 bp，編碼681個氨基酸 (圖1、圖2)。

圖1 AhPDAT1基因的核苷酸及氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of AhPDAT1

2.2 氨基酸序列分析

對AhPDAT1和AhPDAT2基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，AhPDAT1蛋白的理論分子量為78.72 kD，理論等電點(diǎn)為8.66。AhPDAT1包含的700個氨基酸殘基中，Gly(G)含量最高，占總氨基酸的9.1%，其次為Lys(K)，Ala(A)，Leu(L)，分別占總氨基酸的8.0%，7.3%，7.3%。帶負(fù)電的氨基酸殘基有88個(Asp + Glu)，帶正電的氨基酸殘基有97個(Arg + Lys)。親水指數(shù)為0.465，不穩(wěn)定系數(shù)是40.74，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhPDAT1有1個跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhPDAT1屬于跨膜類蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool結(jié)果顯示：AhPDAT1含α-螺旋197個，占28.14 %；β-折疊63個，占9.00 %；無規(guī)則卷曲440個，占62.86 %。

AhPDAT2蛋白的理論分子量為76.32 kD，理論等電點(diǎn)為6.17。AhPDAT2包含的681個氨基酸殘基中，Gly(G)含量最高，占總氨基酸的9.3%，其次為Glu(E)，Ala(A)，Lys(K)，分別占總氨基酸的7.8%，7.6%，6.8%。帶負(fù)電的氨基酸有88個(Asp + Glu)，帶正電的氨基酸有81個(Arg + Lys)。親水指數(shù)0.409，不穩(wěn)定系數(shù)44.48，屬于不穩(wěn)定蛋白。TMHMM在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AhPDAT2有1個跨膜結(jié)構(gòu)，推測AhPDAT2屬于跨膜類蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool結(jié)果顯示：AhPDAT2含α-螺旋191個，占28.05 %；β-折疊65個，占9.54 %；無規(guī)則卷曲425個，占62.41 %。

采用擬南芥、野生種和栽培種花生中PDATs蛋白家族氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析(圖3)。結(jié)果顯示，AhPDAT1氨基酸序列與Arahy.F78IM4.1、Aradu.UA9D8.1、Araip.WVH6X.1氨基酸序列相似性較高，分別為100%、86.6%、88.2%；與AT3G44830.1，AT5G13640.1氨基酸序列相似性較低，分別為55.1%和69.3%。AhPDAT2氨基酸序列與Araip.I19GZ.1、Aradu.S9XBY.1、Arahy.91WX57.1的氨基酸序列相似性較高，分別為99.7%、94.0%、92.45%；與AT3G44830.1，AT5G13640.1氨基酸序列的相似性較低，分別為54.5%和73.2%。因此，AhPDAT1與AhPDAT2編碼的蛋白與野生種花生及擬南芥同源性較大，可能來自于同一家族。

圖2 AhDPAT2基因的核苷酸及氨基酸序列 Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of AhPDAT2

圖3 花生AhPDAT1和AhPDAT2蛋白的多序列比對結(jié)果Fig.3 Comparison of AhPDAT1 and AhPDAT2 amino acid sequence among peanut and other species 注：保守結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)出。 Note: The conserved domain was shownwith boxes.

圖4 花生AhPDAT1和AhPDAT2的基因結(jié)構(gòu) Fig.4 The schematic diagram of the structure of AhPDAT1 and AhPDAT2

AhPDAT1和AhPDAT2基因組全長分別為3918 bp和5630 bp。GSDS工具作基因結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)AhPDAT1和AhPDAT2的基因結(jié)構(gòu)都含有5個內(nèi)含子和6個外顯子。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

如圖5所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，花生AhPDAT1、AhPDAT2基因與擬南芥AT5G13640基因聚在一起，擬南芥AT3G44830基因與大豆基因聚在一起。真核綠藻萊茵衣藻和團(tuán)藻的PDAT基因位于樹的基部，它們可能是高等植物PDAT基因的來源。

圖5 植物PDAT基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic tree of plant PDAT isoforms

圖6 AhPDAT1和AhPDAT2基因在花生不同組織和種子不同發(fā)育時期的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of AhPDAT1 and AhPDAT2 in seven peanut tissues and at five stages of seed development

圖7 AhPDAT1基因在不同非生物逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)分析 Fig.7 Expression analysis of AhPDAT1 under abiotic stresses and hormone treatments

圖8 AhPDAT2基因在不同非生物逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of AhPDAT2 under abiotic stresses and hormone treatments

2.4 基因的表達(dá)特性分析

對AhPDAT1和AhPDAT2基因采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析其特性。內(nèi)參基因選用花生Actin11基因。結(jié)果顯示(圖6)，AhPDAT1基因在種子中的表達(dá)量最高；在種子生長周期中，最后一個發(fā)育時期有著明顯的表達(dá)量。AhPDAT2基因在花生的花中表達(dá)量最高，其次為下胚軸和葉，在種子中表達(dá)量最低。

結(jié)果顯示(圖7)，以0h為參考，在各因子影響下，花生葉片中AhPDAT1基因表達(dá)量有不同表達(dá)，表明該基因可能參與了花生逆境脅迫抗性途徑。其中，低溫處理后24 h時，表達(dá)量大幅上調(diào)，為0 h對照的11倍。高鹽和干旱處理后12 h時基因表達(dá)量最高，分別為0 h對照的40倍和8倍。過氧化氫處理24 h和72h時，表達(dá)量明顯，其余時期表達(dá)量極低。水楊酸處理8 h表達(dá)量最高，是0 h對照的16倍。茉莉酸處理24 h時表達(dá)量最高，為0 h對照的5.5倍。赤霉素處理72h后表達(dá)量達(dá)到最大，為0 h對照的6倍。乙烯利處理48 h時表達(dá)量最大。脫落酸處理后，基因表達(dá)量逐漸上調(diào)，12h后顯著下降。

結(jié)果顯示(圖8)，以0h為參考，在各因子影響下，花生葉片中AhPDAT2基因表達(dá)量不同。其中，低溫處理后72 h時表達(dá)量最高，遠(yuǎn)高于其他時期。高鹽在12h表達(dá)量最高為0 h對照的11倍，干旱在12h和72h表達(dá)量更明顯。過氧化氫和水楊酸處理后72 h時基因表達(dá)量最高，分別為0 h對照的43倍和10倍。茉莉酸處理24 h時表達(dá)量最高，為0 h對照的8倍。赤霉素處理8h后表達(dá)量達(dá)到最大，為0 h對照的2.6倍。乙烯利處理和脫落酸處理表達(dá)量均在24h最大，分別為0 h對照的8倍和6倍。

3 討 論

PDAT基因起源很早，在植物和細(xì)菌中分布廣泛，所編碼的蛋白與DGAT基因所編碼的蛋白在功能上近似，但目前對于PDAT的研究遠(yuǎn)滯后于DGAT。前期研究發(fā)現(xiàn)，PDAT不僅具有TAG合成的功能[19-20]，還在應(yīng)對非生物脅迫中也有重要作用[21-22]。

本實驗克隆得到的AhPDAT1和AhPDAT2基因都屬于PDAT家族，通過進(jìn)化樹分析可以看出二者都與大豆PDAT基因有著比較近的親緣關(guān)系。萊茵衣藻和團(tuán)藻等真核綠藻位于系統(tǒng)發(fā)育樹的根部，因此推測可能為進(jìn)化的來源。這兩個PDAT基因均含有6個外顯子，內(nèi)含子相位高度保守，說明它們在功能上都具有保守性。根據(jù)資料顯示一些保守基序在一少部分植物丟失了，而高度保守的特點(diǎn)在被子植物PDAT蛋白序列更為普遍。PDAT基因功能多樣性和底物特異性的有效證據(jù)之一就是不同物種PDAT基因的表達(dá)方式與結(jié)構(gòu)特性差異明顯[23-24]。

熒光定量結(jié)果顯示AhPDAT1基因在種子中的表達(dá)量最高，其余組織表達(dá)量都很少；而AhPDAT2基因在花生下胚軸中的表達(dá)量最高。AhPDAT1和AhPDAT2基因分別在果針下地后60d和36d的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其余各時期。此外干旱、高鹽、低溫等因素制約植物的產(chǎn)量和生長發(fā)育[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)AhPDAT1和AhPDAT2兩基因?qū)?類脅迫均有響應(yīng)，但是響應(yīng)模式有所不同?？傊?，本研究有助于闡明PDAT基因在花生油脂合成途徑、抗逆等方面的功能，可以為花生育種提供新的基因資源。