王 丹，王旭輝,2，高興旺，李 冠

(1.新疆大學(xué)生物工程研究中心，烏魯木齊　830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL.)是世界十大水果之一，是中國、美國、西班牙、日本、法國、印度、韓國、中亞等多個(gè)國家和地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物[1]。老漢瓜是新疆甜瓜著名的地方品種之一，其葉片呈橢圓形。葉片作為植物進(jìn)行光合作用的重要場所，能高效地將太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬埽瑸槿祟惿嫣峁┭鯕?、食物、纖維、生物質(zhì)能源等[2]。葉片面積大小和葉片形狀均會(huì)對植物產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定影響[3-6]，因此關(guān)于葉片發(fā)育分子機(jī)理的研究自然成為國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)之一[7-9]。研究前期以甜瓜掌狀裂葉自然突變體bm7為主要材料，將甜瓜掌狀裂葉候選基因pll定位到只有一個(gè)候選基因的范圍內(nèi)[10],并發(fā)現(xiàn)甜瓜葉片性狀受一對等位基因控制。為了進(jìn)一步研究甜瓜掌狀裂葉形成的分子機(jī)理，實(shí)驗(yàn)以老漢瓜為研究材料，該品種甜瓜葉形為全緣葉，與甜瓜掌狀裂葉性狀為等位性狀，將控制甜瓜全緣葉性狀的基因命名為PLL。實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對PLL基因進(jìn)行敲除，利用該技術(shù)可為甜瓜掌狀裂葉候選基因的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甜瓜葉片形態(tài)分子建成的機(jī)制的揭示提供參考，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)界也將具有重要的理論意義和學(xué)術(shù)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CRISPR/Cas是廣泛存在于古生菌以及細(xì)菌的基因組中的保守序列，屬于生物自身免疫系統(tǒng)，可對外來入侵的病毒或者質(zhì)粒起降解作用[11]。當(dāng)有外源DNA侵染細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)自身的防御系統(tǒng)開始調(diào)控Crispr轉(zhuǎn)錄成為不成熟的crRNA，也就是前體RNA ，然后在Cas蛋白和核酸酶的作用下對前體RNA進(jìn)行剪切和加工，使其形成含有spacer序列的crRNA,成熟的crRNA與tracrRNA形成復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)Cas蛋白與crRNA配對的序列靶位點(diǎn)結(jié)合，對雙鏈DNA進(jìn)行剪切，從而造成基因的突變，達(dá)到編輯效果[11]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自2012年問世以來，顯示了強(qiáng)大的優(yōu)勢以及廣闊的應(yīng)用前景[12-14]。在動(dòng)物方面，馬小婭等[12]利用CRISPR/Cas9對水牛的基因進(jìn)行敲除，唐雨婷等[13]利用CRISPR/Cas9敲除了豬的β4GalNT2基因。在植物方面，F(xiàn)eng Z Y等[14]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了擬南芥幾個(gè)在功能缺失時(shí)有明顯的生長表型的內(nèi)源基因如GA應(yīng)答基因(GIBBERELLICACIDINSENSITIVE，GAI)，當(dāng)GA基因被敲除以后，擬南芥植株表現(xiàn)出矮小的表型。除了模式植物擬南芥，禹明森等[15]成功建立生菜CRISPR/Cas9敲除體系，唐雨薇等[16]構(gòu)建了茶樹咖啡堿合成酶CRISPR/Cas9敲除載體。在葫蘆科作物中，國外科學(xué)家利用CRISPR/Cas9敲除了番茄的RIN基因[17]，該基因是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在果實(shí)成熟方面起著重要的作用，最終得到了51株突變體，這些突變體產(chǎn)生了不完全成熟的果實(shí)。與野生型比較，其紅色素沉淀也明顯降低。通過對三個(gè)獨(dú)立靶點(diǎn)產(chǎn)生的突變是否可以在T1后代中穩(wěn)定遺傳的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體系產(chǎn)生的編輯效果可以穩(wěn)定遺傳給后代。因此，可以選擇利用CRISPR/Cas9對甜瓜全緣葉基因進(jìn)行敲除，從而研究甜瓜裂葉基因的功能。目前在甜瓜中尚未有編輯成功的例子。實(shí)驗(yàn)所使用的表達(dá)載體帶有潮霉素抗性基因，因此，需要對甜瓜耐受潮霉素的最大濃度進(jìn)行檢測，為下一步的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，抗潮霉素基因是最常用的標(biāo)記基因之一，由于HPT基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)片段較小，約只有1.1 kb左右,其很容易與沒有選擇標(biāo)記的目的片段結(jié)合并導(dǎo)入植物基因組[18]。其毒性機(jī)理是通過干擾植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長因子EF-2的結(jié)合，從而對肽鏈的延長進(jìn)行抑制。當(dāng)潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)化到植株中時(shí)，它使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞或組織具有對潮霉素的抗性，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織則不具備此抗性從而逐漸褐化、死亡，據(jù)此可初步篩選出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。但因潮霉素是高毒性的物質(zhì)，對外植體的毒害作用較大，因此，需要研究其對外植體分化的影響來確定其使用濃度，這對下一步的遺傳轉(zhuǎn)化意義重大。【本研究切入點(diǎn)】Crispr/cas在植物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使實(shí)驗(yàn)有了基礎(chǔ)保障。因此，通過構(gòu)建甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas敲除載體來研究裂葉基因的功能。前期高興旺等[10]將甜瓜裂葉基因pll定位與甜瓜三號染色體上，并證明甜瓜裂葉性狀受隱性單基因控制。目前，尚未對甜瓜裂葉基因pll進(jìn)行功能驗(yàn)證，也未對其等位基因——甜瓜全緣葉基因PLL進(jìn)行功能驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)的成功開展可為甜瓜裂葉性狀分子機(jī)制的揭示奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建新疆甜瓜CRISPR/Cas9基因編輯載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，檢測甜瓜對潮霉素的最大耐受濃度，為揭示甜瓜裂葉性狀的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

以新疆著名的甜瓜地方品種老漢瓜為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料種植于新疆昌吉市試驗(yàn)田。載體為植物敲除載體pP1C4。

1.2　方 法

1.2.1甜瓜全緣葉基因PLL敲除載體的構(gòu)建

1.2.1.1sgRNA靶位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)甜瓜基因組全序列，查找全緣葉基因MELO10784，根據(jù)其外顯子序列，設(shè)計(jì)敲除引物(引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址為http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，設(shè)計(jì)一對20 bp左右的oligo DNA片段作為靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)其正反向引物,引物由北京華大基因合成，純化級別為PAGE。表1

1.2.1.2sgRNA 表達(dá)盒構(gòu)建

使用高保真的DNA聚合酶，以pP1C4載體為模板，利用特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得其對應(yīng)的sgRNA表達(dá)盒。

1.2.1.3線性化敲除載體制備

利用限制性內(nèi)切酶EcoRI、XbaI 對pP1C.4 載體進(jìn)行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，然后切膠回收目的片段，回收片段約14 kb，回收產(chǎn)物OD260/OD280在1.8～2.0。

1.2.1.4重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ對載體及PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，切膠回收目的條帶。然后利用重組酶將載體與目的片段進(jìn)行連接構(gòu)建重組載體。采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。

1.2.1.5陽性菌落鑒定及測序

以構(gòu)建好的載體為模板，U6p.4-F及載體下游通用引物gRNA-R作為檢測引物，進(jìn)行PCR檢測，回收目的片段(pP1C.4 載體回收片段大小為400 bp左右)，再利用U6p.4-F作為測序引物，檢驗(yàn)載體是否連接成功。

1.2.2潮霉素耐受性篩選

因載體所攜帶的抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?，因此，需要對甜瓜耐受潮霉素的最大濃度進(jìn)行檢測。首先對甜瓜種子進(jìn)行表面消毒，先利用70%的乙醇消毒30 s,然后用2%的次氯酸鈉消毒7 min，將表面消毒的種子放置在MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)。萌發(fā)4 d后將葉片切下，將葉片左右兩邊切去，再將葉片分為8份，以不加潮霉素的培養(yǎng)基作為對照組，再設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，每個(gè)培養(yǎng)皿放40個(gè)葉片，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長情況，以及出芽情況，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　全緣葉基因PLL敲除載體的構(gòu)建

2.1.1sgRNA靶位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)CRISPR/Cas9在線設(shè)計(jì)工具，參考軟件自帶評分參數(shù)，選擇GC含量高達(dá)60%且特異性較高的位點(diǎn)用與sgRNA載體的構(gòu)建，靶位點(diǎn)序列信息為GAAGTCCATGAATGATAATGAGG。研究所用引物均由軟件Primer Primer5.0設(shè)計(jì)，具體引物序列信息見表1。

表1引物序列信息
Table1Primer sequencing information

引物名稱Primername引物序列(5’-3＇)Primersequence用途FunctionU6p．4-FCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC擴(kuò)增sgRNA，測序驗(yàn)證FW-RGCTATTTCTAGCTCTAAAACCATTATCATTCATGGACTTCAATCACTACTTCGACTCT擴(kuò)增sgRNAgRNA-RAGCACCGACTCGGTGCCAC陽性菌落驗(yàn)證

2.1.2sgRNA表達(dá)盒的獲取

以pP1C.4載體為模板，通過特異性引物U6p.4-F，F(xiàn)W-R成功擴(kuò)增到目的片段。圖1(1)，圖1(2)是全緣葉基因gRNA的PCR產(chǎn)物,以DL3000 DNA Marker為參照，成功克隆出了300 bp左右目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收，經(jīng)測序驗(yàn)證，成功獲得sgRNA表達(dá)盒。圖1

2.1.3線性化載體的制備

利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ對載體進(jìn)行雙酶切，電泳后顯示條帶大小與預(yù)期一致，說明載體被成功酶切。回收酶切片段，將回收條帶低溫保存?zhèn)溆谩?OD260/OD280的值為2.0)。圖2

2.1.4陽性菌落PCR檢測

將重組載體利用重組酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上長出的大腸桿菌單菌落隨機(jī)挑取6個(gè)進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果得到約400 bp左右的片段，目的條帶明亮單一且符合預(yù)期，再將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，證明成功將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。圖3

注：1～2：sgRNA框；M：DL3000 DNA Marker

Note: 1-2;sgRNA frame M：DL3000 DNA Marker

圖1sgRNA表達(dá)盒的擴(kuò)增
Fig.1Amplification of sgRNA

注：1～2:XbaⅠ,EcoR Ⅰ雙酶切后的載體片段；M:DL10K DNA Marker

Note: 1-2;XbaⅠ、EcoRⅠ Enzyme cut vector fragment; M:DL10K DNA Marker

圖2 雙酶切的載體片段
Fig.2 Enzyme cut vector fragment

注:1～6：陽性大腸桿菌；M:DL3000 DNA Marker

Note: 1-6:recombinant plasmid;M:DL3000 DNA Marker

圖3重組質(zhì)粒PCR鑒定
Fig.3PCR of recombinant plasmid

2.1.5陽性菌落測序鑒定

華大基因測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒成功插入了靶位點(diǎn)序列，含有靶位點(diǎn)的sgRNA片段與載體片段完全一致，證明成功構(gòu)建了甜瓜PLL基因敲除載體。圖4

圖4陽性菌落測序結(jié)果
Fig.4Sequencing results of positive colonies

2.2　潮霉素耐受性篩選

研究表明，當(dāng)不加潮霉素時(shí)，愈傷組織均可長出，其生長率為100%。加入5 mg/L的潮霉素時(shí)雖然有41%的葉片長出了愈傷組織，但沒有發(fā)育成正常的單芽或者叢生芽。加入潮霉素濃度為10、15、20 mg/L的培養(yǎng)基中的葉片均沒有長出愈傷組織，且組織塊逐漸褐化，最終死亡。該結(jié)果說明甜瓜愈傷組織對潮霉素最大的耐受濃度為10 mg/L。表2

表2甜瓜對不同濃度潮霉素的耐受性檢測
Table2Tolerance detection of different concentrations of melon to Hygromycin

潮霉素濃度　Hygromycinconcentration(mg/L)05101520葉片總數(shù)Totalnumberofleaves(個(gè))404040404040404040404040404040愈傷組織個(gè)數(shù)Numberofcallus(個(gè))402200040130004014000

3　討 論

很多物種利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行了性狀改良，基因編輯的方法主要有巨核酶技術(shù)、鋅指合酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)和CRISPR相關(guān)的核酸酶技術(shù)[19]。這些技術(shù)均被應(yīng)用到多種基因工程相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中。但他們也有各自的缺點(diǎn),相比于CRISPR相關(guān)的核酸酶技術(shù)，其余的基因編輯技術(shù)操作流程復(fù)雜，需要對相應(yīng)的酶進(jìn)行改造才能識別靶位點(diǎn)序列從而產(chǎn)生編輯效應(yīng)。而利用CRISPR載體不需要那么繁瑣的改造，只需要構(gòu)建特異的sgRNA與Cas蛋白結(jié)合就可以對基因進(jìn)行編輯，極大簡化了基因編輯的過程，相比較其他的方法在基因編輯方面具有更大的潛力。關(guān)于CRISPR/Cas9產(chǎn)生的突變效率問題一直是科學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)之一，CRISPR/Cas9編輯效率受很多因素的影響，因此，可以從多方面去提高編輯效率。楊秀榮[20]利用BbsⅠ單酶對載體進(jìn)行酶切并進(jìn)行載體構(gòu)建。在該實(shí)驗(yàn)中,利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ對載體及PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后利用重組酶將酶切后的載體與PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，從而構(gòu)成一個(gè)完整的載體。楊學(xué)飛等[21]通過對利用單個(gè)酶切位點(diǎn)與兩個(gè)酶切位點(diǎn)的選擇時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用BbSⅠ單酶切位點(diǎn)克隆到載體中，會(huì)使假陽性的概率升高，連接效率變低，通過改造將BbSⅠ酶切位點(diǎn)替換成AfeⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)后，連接效率大幅度提高，出現(xiàn)假陽性的概率很小。因此,選用XbaⅠ、EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行載體的構(gòu)建，從而降低假陽性的概率，提高連接和編輯效率。另一方面可以通過串聯(lián)多個(gè)sgRNA來提高編輯效率。劉丁源等[22]通過串聯(lián)多個(gè)sgRNA敲除擬南芥IAA2基因，結(jié)果表明，通過串聯(lián)多個(gè)sgRNA可以產(chǎn)生堿基插入突變以及大片段缺失突變等多種可遺傳突變。與單個(gè) sgRNA相比，串聯(lián)多重sgRNA的基因敲除效率高、種系突變多。因此，在以后的工作中可以采取串聯(lián)多個(gè)sgRNA來提高編輯效率。

潮霉素在很多基因工程的實(shí)驗(yàn)中作為篩選劑，王哲等[18]研究煙草 K326葉片直接誘導(dǎo)分化再生苗的潮霉素篩選濃度為5～20 mg/ L。王節(jié)之等[23]還研究了谷子對潮霉素的最大耐受濃度，發(fā)現(xiàn)愈傷組織從5 mg/L開始變黃，臨界抗性濃度不超過10 mg/L，同樣利用潮霉素作為篩選劑，檢測甜瓜對潮霉素最大耐受濃度，確定陽性植株的篩選濃度。通過檢測發(fā)現(xiàn)甜瓜對潮霉素的耐受濃度為10 mg/L。在潮霉素濃度為5 mg/L的時(shí)候，約有40%的葉片不會(huì)分化出愈傷組織，在潮霉素濃度達(dá)到10 mg/L的時(shí)候，所有的葉片均出現(xiàn)褐化，并逐漸死亡，這與顏雪等[24]的結(jié)果一致，顏雪等對伽師瓜耐受潮霉素的濃度進(jìn)行檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)伽師瓜耐受潮霉素的最大濃度也為10 mg/L，因此，可以初步判定甜瓜一般可耐受潮霉素的最大濃度為10 mg/L。因此，在陽性植株檢測時(shí)，添加10 mg/L的潮霉素可初步篩選出陽性植株。

甜瓜在田間葉片形狀一般為橢圓形，但在田間發(fā)現(xiàn)裂葉突變體，其葉片與普通甜瓜種質(zhì)資源全緣葉不同，表現(xiàn)為掌狀裂葉的形態(tài)。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過圖位克隆策略已將pll基因定位到甜瓜基因組三號染色體上，通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)裂葉基因與全緣葉基因共同控制葉片的形狀，高興旺等對其進(jìn)行了簡單的分析，但未對基因進(jìn)行克隆，更未對其進(jìn)行功能驗(yàn)證。因此該研究利用CRISPR/Cas9構(gòu)建全緣葉基因的敲除載體，下一步利用凍融法將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，為進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié) 論

結(jié)合甜瓜基因組序列數(shù)據(jù)構(gòu)建甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體，經(jīng)電泳及測序檢測，構(gòu)建了甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體，并確定了甜瓜對潮霉素的最大耐受濃度為10 mg/L。現(xiàn)已將載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，經(jīng)菌落PCR檢測，已獲得陽性農(nóng)桿菌菌落，下一步進(jìn)行甜瓜愈傷組織的轉(zhuǎn)化以期得到陽性植株，為揭示裂葉基因的功能打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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