張宏梅 ， 鄭文彧 ， 劉 迪 ， 時文艷 ， 孫宏宇 ， 崔佰吉 ， 高俊濤 ， 馮憲敏

(1.吉林醫(yī)藥學院病原生物學教研室 ， 吉林 吉林 132013 ； 2.吉林市中心醫(yī)院 ， 吉林 吉林 132000)

棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba Keratitis，AK)是一種嚴重威脅視力的感染性眼病, 其發(fā)生與一定的危險因素有關，如配戴角膜接觸鏡、接觸污染的水源、角膜輕度擦傷，以及機體抵抗力降低等[1-2]。目前為止，對棘阿米巴原蟲的研究主要集中在形態(tài)分型、基因分型、藥物殺傷試驗、感染模型和致病機制研究階段，對于棘阿米巴角膜炎的病因學、免疫學、病理生理學以及診斷治療等方面的研究仍有待深入。在前期工作中，課題組成功構建了棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體全長cDNA文庫[3]和棘阿米巴角膜炎的兔模型[4]。本文通過棘阿米巴感染兔血清對構建好棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體全長cDNA文庫進行免疫學篩選，以期獲得高反應原性的抗原基因，為進一步棘阿米巴原蟲感染的快速診斷試劑和免疫預防分子的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株 棘阿米巴原蟲標準蟲株(Acanthamoebahealyi)由延邊大學病原教研室惠贈，本室凍存。將棘阿米巴原蟲純培養(yǎng)于蛋白胨-酵母-葡萄糖培養(yǎng)基(Peptone-Yeast-Glucose, PYG)中, 取對數(shù)生長期的滋養(yǎng)體， 生理鹽水調整原蟲濃度為1×106/mL(90%以上滋養(yǎng)體)，并用臺盼藍染色檢測蟲體活力>90%，用于試驗。

1.2 試劑與儀器 棘阿米巴cDNA和原始cDNA文庫由本室制備，-80 ℃冷凍保存[3]。E.coliXL1-Blue，PBST，辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG，RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒，2×TaqPCR Green Mix，引物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.3 免疫血清制備

1.3.1 感染兔模型 健康新西蘭白兔6只(吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供)，體重2.0～2.5 kg，雌雄兼用。試驗組4只，對照組2只。試驗組單眼注射，左眼為試驗眼,右眼為病變對照眼。實驗前實驗眼用0.5%氫化可的松滴眼液點眼, 每天3～4次，共3 d。實驗開始后,停用激素。試驗組兔固定后，經氯胺酮肌肉注射全麻后，左眼再經0.5%可卡因點眼局麻,用1 mL無菌注射器向實驗眼角膜基質內注射棘阿米巴原蟲混懸液0.2 mL(1×106/mL)，2只對照兔左眼角膜基質內注射等量生理鹽水，右眼未做處理。于注射12 h開始，每天觀察兔眼角膜病變情況，直到處死(42 d)[5]。

1.3.2 10%氫氧化鉀濕封片鏡檢 分別于注射后3 d、7 d、14 d及28 d，刮取兔角膜較深層病變組織涂于滴加10%KOH的載玻片上，置于光學顯微鏡下查找滋養(yǎng)體或包囊。

1.3.3 血清抗體滴度檢測 分別于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳緣靜脈或動脈取血，制備血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兔血清中抗棘阿米巴原蟲抗體的滴度。將棘阿米巴蟲體粗抗原(濃度為1.63 2 mg/mL)稀釋至10 μg/mL，按每孔100 μL包被96孔板，4 ℃過夜。次日用0.05 mol/L pH值7.4的PBS-Tween-20(PBST)洗液洗滌3次，每次5 min；3%脫脂奶粉每孔100 μL封閉1 h，PBST洗滌后，加入稀釋的兔血清(1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000, 1∶32 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后，加入1∶5 000稀釋的二抗(bs-0295G-HRP rabbit IgG/HRP，公司)，37 ℃孵育5 h；PBST洗滌后，以TMB為底物顯色10 min，4 mol/L硫酸終止反應，用bio-rad 680酶標儀(美國)測定OD450值。

1.4 cDNA文庫滴度測定 取1 μL原始文庫，用1×λ dilution Buffer 分別進行1×10-3、1×10-4和1×10-5倍稀釋。從每個濃度分別吸取1 μL加入至100 μLE.coliXL1-Blue感受態(tài)細胞，37 ℃孵育15 min。將上述混合液與6 mL LB/MgSO4/麥芽糖軟頂瓊脂混合后傾注平板，室溫冷卻，于37 ℃培養(yǎng)16～18 h。計數(shù)溶菌斑數(shù)量，以確定該文庫的滴度。

1.5 cDNA文庫免疫篩選 1×10-3稀釋的棘阿米巴cDNA文庫0.5 μL，加入至100μLE.coliXL1-Blue感受態(tài)細胞，37 ℃孵育15 min。將上述混合液與6 mL LB/MgSO4/麥芽糖軟頂瓊脂混合后傾注平板，室溫冷卻，于37 ℃培養(yǎng)16～18 h，至噬菌斑清晰可見，未融合。將預先準備好的140 mm直徑的PVDF膜覆蓋于噬菌斑表面，標記固定，37 ℃正置孵育4 h，4 ℃倒置過夜。取下PVDF膜，PBST洗滌3次后，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，洗滌后首抗和二抗各自孵育1 h，DAB顯色。首抗：分別取1 μL感染后第7、14、21天和28天兔血清，混合后，與E.coliXL1-Blue裂解液室溫混合過夜；次日2 000×g，室溫離心10 min，收集上清，用抗體稀釋液進行1∶5000 稀釋。二抗：辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG，使用濃度1∶500。從培養(yǎng)板上挑取陽性克隆置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 1×λdilution Buffer，4 ℃過夜；次日離心取上清進行復篩和測序。

1.6 陽性克隆測序與序列分析 將上述噬菌體溶液送北京鼎國昌盛生物技術有限公司采用通用引物T3和T7進行雙向測序。根據(jù)測序結果，采用ORF finder軟件進行ORF預測,并對預測的氨基酸序列進行Blastp同源性分析。同時根據(jù)堿基序列設計特異性引物，以棘阿米巴cDNA為模板進行擴增檢測，PCR反應體系為：2×TaqPCR Green Mix，12.5 μL；Ameba cDNA，0.5 μL；引物F/R各1 μL；無核酸酶的去離子水至總體積25 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；92 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠，進行電泳，PCR產物回收，進行二次測序。

2 結果

2.1 免疫兔血清制備 在家兔角膜感染棘阿米巴原蟲后3、7、14 d及28 d分別作角膜深層組織刮片，滴加10%KOH，置于光學顯微鏡下觀察，4只試驗眼均查見滋養(yǎng)體或包囊(圖未列出)，表明感染模型構建成功。

分別于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳緣靜脈或動脈取血，制備血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兔血清中抗棘阿米巴原蟲抗體的滴度。隨著感染的進行,實驗組兔血清抗體水平于感染后的第7天開始逐漸升高，第28天達到峰值，而后抗體滴度開始緩慢下降；陰性對照組兔血清抗體水平沒有明顯變化(圖1)。根據(jù)抗體水平的變化，選用感染后第7、14、21天和28天兔血清進行文庫的免疫學篩選。

圖1 兔棘阿米巴角膜炎模型血清抗體滴度的變化

2.2 cDNA文庫的免疫學篩選和序列分析 對培養(yǎng)板上的噬菌斑進行計數(shù)，計算出cDNA文庫滴度為3.88×107PFU/mL。用預吸附的感染兔血清對棘阿米巴原蟲cDNA文庫進行初篩和復篩，獲得3個持續(xù)陽性克隆(圖2)。根據(jù)測序結果，采用NCBI-Blastp對氨基酸序列的同源性進行比對。如表1顯示，克隆1插入序列長度為956 bp，含有一個774 bp的開放閱讀框架，編碼258個氨基酸，分子量大小為29.13 kDa，GenBank注釋為肌動蛋白1(actin1)；克隆2插入序列長度為658 bp，含有一個234 bp的開放閱讀框架，編碼78個氨基酸，分子量大小為8.96 kDa，GenBank注釋為聚泛素(polyubiquitin)；克隆3插入序列長度為1 290 bp，含有一個564 bp的開放閱讀框架，編碼188個氨基酸，分子量大小為21.36 kDa，GenBank注釋為熱休克蛋白20(HSP20)。

表1 3個陽性克隆序列比對分析

圖2 棘阿米巴cDNA文庫的免疫學篩選

根據(jù)測序結果設計特異性引物，以棘阿米巴原蟲cDNA為模板進行PCR擴增鑒定，結果顯示，3個陽性克隆全部擴增出特異條帶，插入的cDNA片段大小分別為774 bp、234 bp和564 bp(圖3)，與序列比對結果一致。

3 討論

棘阿米巴角膜炎(AK)是由自由生棘阿米巴原蟲感染引起的一種致盲性眼病。其發(fā)生與一定的危險因素有關，如佩戴角膜接觸鏡、接觸污染的水源、角膜擦傷、眼部外科手術以及機體抵抗力降低等。棘阿米巴原蟲的生活史包括滋養(yǎng)體和包囊兩個階段，滋養(yǎng)體的繁殖速度極快，感染包囊3 d內可轉變?yōu)樽甜B(yǎng)體，侵入組織或經過治療后又可以轉變成包囊，包囊抵抗力極強，不易被殺滅，故該病治療預后不良[6-9]。臨床診斷的標準為病原學診斷，其樣本的采集主要為角膜刮片，診斷率低，不易被患者所接受。此外，由于AK患者早期癥狀不特異，臨床上容易和病毒性或真菌性角膜炎混淆，發(fā)生漏診、誤診和誤治，導致疾病的惡化[10-11]。因此對AK感染的預防和早期診斷一直是亟待解決的問題。隨著分子生物學和分子免疫學的發(fā)展，基因工程重組診斷抗原和分子疫苗的研究成為診斷試劑，以及疫苗研發(fā)的重要手段。cDNA表達文庫和感染血清篩選是分離和鑒定抗原候選基因的常用方法之一。

前期工作中，課題組通過SMART法構建了棘阿米巴原蟲的cDNA表達文庫。在本研究中通過角膜注射構建棘阿米巴角膜炎兔模型，并獲得用于文庫免疫學篩選的感染血清。根據(jù)抗體滴度的變化規(guī)律，選用感染后第7、14、21天和第28天的混合血清，去除E.coliXL1-Blue交叉反應性后，對文庫進行免疫學篩選。經過三輪的初篩和復篩，共得到6個基因的表達產物可以與感染血清發(fā)生特異性結合。經序列比對后，其中3個基因(actin1、polyubiquitin和HSP20)在棘阿米巴原蟲基因庫中具有明確的注釋。為進一步的基因克隆，原核表達系統(tǒng)的構建、誘導表達和鑒定，以及AK的免疫診斷和疫苗的研究奠定了基礎，但三者在棘阿米巴入侵和致病過程中的作用有待進一步研究。

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