趙 亮 曹 陽 徐 莉

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，錦州 121000)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的損傷，不僅會由創(chuàng)傷導(dǎo)致的直接損傷，還會出現(xiàn)脊髓局部伴發(fā)一定的繼發(fā)性病理改變，與原發(fā)性損傷相比，這種損傷的危害性要強[1]。隨著臨床醫(yī)學(xué)水平的提高，出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡這一概念，隨之也就證實了當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一種比較常見的情況[2]。換言之，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用。目前，對于中樞神經(jīng)損傷的治療措施比較多，比如：手術(shù)治療、藥物治療、高壓氧治療、微波治療等，但效果均不佳[3，4]。本文就50只大鼠為實驗對象，觀察重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉在大鼠脊髓損傷中的治療功效。

1 材料與方法

1.1實驗材料 選購錦州醫(yī)科大學(xué)動物中心的雌性成年SD大鼠，共計50只，體重：240～260 g，平均體重為(251.2±18.6)g。依據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為5組，每組各10只。即空白組(僅暴露，不損傷脊髓)、損傷組(損傷脊髓，但不使用藥物)、rhEPO組(僅使用重組人紅細(xì)胞生成素治療)與β-SE組(僅使用β-七葉皂甙鈉治療)、聯(lián)合治療組(同時應(yīng)用重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉治療)。

1.2方法

1.2.1動物模型的制作 脊髓損傷模型采用Nystrom法[5]進(jìn)行制備。首先，對大鼠采用10%水合氯醛 (上海銘博生物科技有限公司)0.4 ml/100 g腹腔注射進(jìn)行麻醉，無菌操作，背部正中背皮，然后進(jìn)行背部中段正中切口，仔細(xì)咬除T13椎板及黃韌帶，將35 g自制標(biāo)準(zhǔn)重錘通過2.5 mm×5.0 mm弧形光滑金屬墊片壓迫于該段脊髓后正中，時間為5 min，致以中度脊髓損傷。術(shù)后每日人工擠壓膀胱排尿3次至自主排尿。

1.2.2治療方法 在造膜成功之后的1 h，經(jīng)尾靜脈給藥。空白組：不給予打擊及治療，經(jīng)尾靜脈推注劑量相同的生理鹽水(浙江濟民制藥股份有限公司)。損傷組：打擊后給予等量生理鹽水作為對照。rhEPO組：打擊后僅使用重組人紅細(xì)胞生成素(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)，劑量與方法等同聯(lián)合治療組。β-SE組：打擊后予以0.1 mg/kg的β-七葉皂甙鈉(山東綠葉制藥股份有限公司)，使用鹽水稀釋后行靜脈推注，每天一次，連續(xù)使用7 d。聯(lián)合治療組：打擊后予以0.1 mg/kg的β-七葉皂甙鈉，使用鹽水稀釋后行靜脈推注，每天一次，連續(xù)使用7 d；重組人紅細(xì)胞生成素每天1次，行靜脈推注，使用劑量為300 U/kg。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1神經(jīng)功能評判標(biāo)準(zhǔn)[6]主要包括行為觀察與斜板試驗。①行為觀察[7]：0分代表損傷平面之下未見任何反應(yīng)，雙后肢無肌力，感覺喪失；6分代表能夠正常行走、跑。分值越高，行為能力越強。②斜板試驗：采用改良的 Rivlin法[8]，大鼠置于40×80 cm的平整木板之上，呈俯臥狀，頭側(cè)方緩慢的抬高，當(dāng)大鼠往下滑行時，對大鼠功能恢復(fù)的情況進(jìn)行觀察。對脊髓損傷大鼠進(jìn)行斜板傾斜角度的測定，測定的時間分別于術(shù)后4 h、1 d、4 d、7 d、14 d。

1.2.3.2組織學(xué)檢查 術(shù)后對五組大鼠在各個時間點進(jìn)行功能評分，其中空白組取材在對大鼠進(jìn)行觀察的末期進(jìn)行，另外四組大鼠麻醉下，將大鼠的損傷段脊髓取出，取損傷中心部位約5 mm，橫切面以5 mm厚度連續(xù)切片，HE 染色，觀察脊髓組織的形態(tài)變化，另外觀察脊髓組織的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3.3NF-κB 的免疫組化檢測 針對NF-κB 表達(dá)的具體表現(xiàn)，本次采取SP方案來實施，標(biāo)本取得后行免疫組化染色。試劑：北京中山公司(SP染色)，一抗用PBS來替換形成陰性對照，保證一抗工作濃度為1∶100。清洗載玻片并用粘合劑處理，常規(guī)脫臘至水，用 3%H2O2室溫孵育 10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗、PBS 沖洗等處理，最后 DAB 顯色，蘇木素復(fù)染 1 min，水洗，1%鹽酸酒精分化，脫水，透明，封固。圖像分析，細(xì)胞著色處理，顏色如棕黃色或棕褐色。之后顯微鏡收集圖像和圖片數(shù)據(jù)處理，軟件為HPIAS-2000，全自動分析，獲取和保存陽性細(xì)胞的吸光度值，每個切片的NF-κB 相對含量采用上述吸光度值的平均值來記錄。

1.2.3.4脊髓組織Ca2+、Mg2+含量檢測 將脊髓組織于烘箱中烘焙，直到恒重后，然后加入濃硝酸和高氯酸混合溶液5 ml，其中濃硝酸∶高氯酸的比例按照5∶2 進(jìn)行，常溫消化48 h，燒瓶消化液放置，500℃石棉爐時間1 h，5%鹽酸溶解燒瓶無機物，進(jìn)行定容，用原子發(fā)射光譜儀中對Ca2+、Mg2+含量進(jìn)行測定。Ca2+或者M(jìn)g2+含量為：測定標(biāo)準(zhǔn)液Ca2+或者M(jìn)g2+濃度/樣本干重×稀釋倍數(shù)(μg/g樣本干重)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠在不同時間的BBB評分比較 空白對照組大鼠的功能表現(xiàn)比較穩(wěn)定，空白對照組大鼠的神經(jīng)功能正常，評分均為 21 分。12 h 后，損傷組、rhEPO組、β-SE組大鼠的功能均沒有恢復(fù)，聯(lián)合治療組的大鼠出現(xiàn)部分功能恢復(fù)。其中，損傷組大鼠的功能受損表現(xiàn)比較嚴(yán)重，并且大鼠的恢復(fù)也非常緩慢，損傷后14 d 時，損傷組大鼠的評分值升至最大，達(dá)8分左右。本組結(jié)果顯示，損傷組BBB 運動功能評分均顯著低于rhEPO組、β-SE組和聯(lián)合治療組，組間比較差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。另外，聯(lián)合治療組運動功能恢復(fù)表現(xiàn)比較明顯，14 d 時，聯(lián)合治療組的評分至19分，與空白對照組比較，功能基本接近正常。本組調(diào)查顯示，rhEPO組、β-SE組功能恢復(fù)表現(xiàn)比較緩慢，在1、3、5、7、14 d的評分值均高于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在14 d時，rh-EPO組、β-SE組兩組的評分值升至最大值，但是與空白組比較，差異比較大，另外，大鼠尚存留部分肢體功能殘疾。見表1。

2.2各組神經(jīng)功能的觀察與評價對比 空白組動物的神經(jīng)功能正常、運動正常。rhEPO組、β-SE組、聯(lián)合治療組的神經(jīng)功能要比損傷組好，且其中聯(lián)合治療組的神經(jīng)功能優(yōu)于rhEPO組、β-SE組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。

2.3各組大鼠脊髓損傷后NF-κB免疫組化檢測結(jié)果比較 NF-κB陽性細(xì)胞一般在以下的細(xì)胞中比較常見，比如脊髓神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，并且在胞質(zhì)或者是胞核中會著色，主要表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色，見圖1～3。本組資料顯示，空白組出現(xiàn)較少的 NF-κB 陽性細(xì)胞。損傷組傷后4 h NF-κB 的表現(xiàn)比較明顯，其中，在14 h出現(xiàn)了最高峰，之后開始出現(xiàn)下降趨勢，在傷后7 d ，NF-κB已降低為正常的水平。NF-κB 表達(dá)比較，聯(lián)合治療組顯著低于損傷組、Rh-EPO組、β-SE組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Rh-EPO組、β-SE組顯著低于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中以8、12 h兩時間點尤為顯著(P<0.01)。空白對照組均顯著低于其他四組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。傷后7 d，rhEPO組、β-SE組、聯(lián)合治療組的 NF-κB 含量均已明顯下降至正常水平。見表3。

2.4各組大鼠脊髓損傷后組織Ca2+、Mg2+含量比較 大鼠脊髓損傷后空白對照組Ca2+含量顯著高于損傷組、rhEPO組、β-SE組及其聯(lián)合治療組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，rhEPO組、β-SE組、聯(lián)合治療組的Ca2+含量顯著高于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組的Ca2+含量顯著高于rhEPO組、β-SE組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战MMg2+含量顯著低于損傷組、rhEPO組、β-SE組及其聯(lián)合治療組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，rhEPO組、β-SE組、聯(lián)合治療組的Mg2+含量顯著低于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組 的Mg2+含量顯著低于rhEPO組、β-SE組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表1各組在不同時間的BBB評分比較

Tab.1ComparisonofBBBscoresateachtimeineachgroup

ProjectBlankcontrolgroupInjurygroupβ-SEgrouprhEPOgroupCombinationtherapygroupAfterinjury1d210.33±0.572.01±1.011)2.68±1.031)4.23±0.581)2)3)Afterinjury3d212.21±1.123.62±0.861)3.69±1.341)8.33±1.541)2)3)Afterinjury5d213.98±1.168.23±1.161)8.55±1.181)11.41±1.461)2)3)Afterinjury7d215.64±1.569.46±1.471)9.37±1.511)16.12±1.831)2)3)Afterinjury14d217.93±2.4613.39±2.361)13.23±2.311)19.68±2.181)2)3)

Note：Compared with the injury group，1)P<0.01；compared with the rhEPO group，2)P<0.01；compared with the β-SE group，3)P<0.01.

ProjectTimeBlankcontrolgroupInjurygroupβ-SEgrouprhEPOgroupCombinationtherapygroupBehaviorevaluation(score)4h6.0±2.00.3±0.10.7±0.31)0.6±0.21)0.9±0.31)1d6.0±2.00.6±0.30.9±0.31)0.8±0.21)1.0±0.31)4d6.0±2.01.2±0.32.3±0.71)2.1±0.61)3.5±1.31)2)3)7d6.0±2.01.6±0.33.0±0.41)3.1±0.91)4.8±1.31)2)3)12d6.0±2.01.8±0.43.6±0.51)3.4±1.11)5.2±1.21)2)3)Swashplateangle(°)4h73.3±16.410.1±5.815.2±6.11)15.3±2.91)23.1±3.61)2)3)1d72.3±15.411.23±6.322.9±7.61)23.1±2.71)37.0±3.51)2)3)4d71.2±8.915.3±3.625.4±3.81)25.6±3.71)40.3±5.11)2)3)7d70.3±9.518.3±3.829.5±3.31)30.1±3.41)48.6±4.51)2)3)12d69.6±11.822.4±4.136.1±3.21)38.3±4.51)54.0±6.51)2)3)

Note：Compared with the injury group，1)P<0.01；compared with the rhEPO group，2)P<0.01；compared with the β-SE group，3)P<0.01.

圖1 各組Bcl-2的表達(dá)(×400)Fig.1 Expression of Bcl-2 in each group(×400)Note: From left to right were the expression of injury group,β-SE group,rhEPO group and Combination therapy group

圖2 各組bax的表達(dá)(×400)Fig.2 Expression of bax in each group(×400)Note: From left to right were the expression of injury group,β-SE group,rhEPO group and Combination therapy group

表3各組大鼠脊髓損傷后NF-κB免疫組化檢測結(jié)果比較

Tab.3ComparisonofNF-κBimmunohistochemicalresultsafterspinalcordinjuryineachgroup

ProjectBlankcontrolgroupInjurygroupβ-SEgrouprhEPOgroupCombinationtherapygroupAfterinjury4h4.85±0.0430.04±0.5222.12±0.301)22.68±0.311)12.21±0.532)3)4)Afterinjury8h4.85±0.0440.17±0.9829.87±0.561)28.78±0.581)19.98±0.962)3)4)Afterinjury14h4.85±0.0455.68±0.5742.95±1.011)42.77±1.041)15.33±0.542)3)4)Afterinjury1d4.85±0.0434.61±0.3823.97±0.561)23.95±0.551)14.41±0.422)3)4)Afterinjury3d4.85±0.0422.47±0.5211.14±0.261)11.23±0.271)12.13±0.542)3)4)Afterinjury5d4.85±0.0415.64±0.415.92±0.091)5.91±0.081)10.12±0.382)3)4)Afterinjury7d4.85±0.044.49±0.234.93±0.094.82±0.074.88±0.21

Note：Compared with the injury group，1)P<0.01；compared with the rhEPO group，2)P<0.01；Compared with the β-SE group，3)P<0.01；compared with the blank control group，4)P<0.05.

ProjectBlankcontrolgroupInjurygroupβ-SEgrouprhEPOgroupCombinationtherapygroupCa2+contents(μg/g)Afterinjury1h811±12485±152)3)4)623±231)3)4)625±241)2)4)756±261)2)3)4)Afterinjury1d809±12423±142)3)4)612±191)3)4)614±201)2)4)716±241)2)3)4)Afterinjury2d810±12468±172)3)4)596±181)3)4)598±191)2)4)693±221)2)3)4)Mg2+contents(μg/g)Afterinjury1h395±5546±122)3)4)435±212)3)4)433±191)2)4)411±121)2)3)4)Afterinjury1d395±5503±82)3)4)486±111)3)4)492±111)2)4)456±91)2)3)4)Afterinjury2d395±5512±132)3)4)503±131)3)4)508±111)2)4)467±81)2)3)4)

Note：Compared with the injury group，1)P<0.01；compared with the rhEPO group，2)P<0.01；compared with the β-SE group，3)P<0.01；compared with the blank control group，4)P<0.05.

圖3 各組fas的表達(dá)(×400)Fig.3 Expression of fas in each group(×400)Note: From left to right were the expression of injury group,β-SE group,rhEPO group and Combination therapy group

3 討論

SCI是致殘的一個非常重要因素，對患者的生命健康造成嚴(yán)重的影響。另外，還有一大部分 SCI 是由于原發(fā)性損傷處理措施不到位，從而引起更加嚴(yán)重的繼發(fā)性損害[9，10]，β-七葉皂甙鈉(β-SE)是七葉樹科植物中提取的皂甙鈉鹽，是一種無菌制劑。首先能夠起到促進(jìn)機體ACTH的提高，另外還能促進(jìn)可的松血漿濃度的提高，能有效促進(jìn)拮抗前列腺素E1(Prostaglandin E1，PGE1)增加，對機體中的自由基實現(xiàn)徹底清除，以此來發(fā)揮有效的抗炎效果，另外還能發(fā)揮抗?jié)B出作用；其次，β-SE還能起到改善微循環(huán)的作用，能起到有效消除局部腫脹的效果[12，13]。總的來說，使用β-七葉皂甙鈉治療脊髓損傷可有效保護脊髓神經(jīng)細(xì)胞的亞微結(jié)構(gòu)，有利于神經(jīng)功能的進(jìn)一步恢復(fù)。

重組人紅細(xì)胞生成素的作用機理在于：靶細(xì)胞在受到重組人紅細(xì)胞生成素的刺激之后，伴發(fā)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+聚集。單一的紅系前體細(xì)胞在受到重組人紅細(xì)胞生成素的刺激之后，細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度便會隨之升高，發(fā)生這種變化的因素在于細(xì)胞中Ca2+的重新分布，并不是由于細(xì)胞之外的Ca2+進(jìn)入到細(xì)胞中[14]。因而，重組人紅細(xì)胞對脊髓損傷之后的細(xì)胞內(nèi)鈣過載起到抑制作用。除此之外，當(dāng)重組人紅細(xì)胞生成素作用于靶細(xì)胞之后，會發(fā)生另一種效應(yīng)便是增加細(xì)胞內(nèi)的DNA合成。同時，血紅蛋白的合成也會在一定程度上受到影響。

通過重組人紅細(xì)胞生成素的使用，可促使血液紅細(xì)胞數(shù)的增加，繼而增加血氧飽和度，使血氧含量大幅增加。就此來看，重組人紅細(xì)胞生成素可有效改善損傷區(qū)的血氧供應(yīng)，對局部微循環(huán)有著很好的改善效用[15]。胡楊等[16]研究表明，rhEPO通過調(diào)控NF-κB而起到抗炎的作用[17]。任憲盛等[18]研究發(fā)現(xiàn):rhEPO能夠明顯降低脊髓損傷后丙二醛含量，因此能明顯減輕SCI后的超微結(jié)構(gòu)改變，因此可以起到很好的保護脊髓組織的效果，從而起到保護神經(jīng)的作用。

目前常用的評分方法包括以下幾個方面：①斜板試驗；②Talove評分法；③Gale行為學(xué)評分法。與其他的評價方法進(jìn)行比較，斜板試驗具有操作簡單、方便的效果[19]。BBB神經(jīng)功能評定法，更加詳細(xì)的對神經(jīng)功能的改善進(jìn)行了描述，同時還減少了一些人為因素對評分的干擾，提高了評分的準(zhǔn)確性。本組實驗采取斜板法和BBB評分法這兩組辦法相結(jié)合的評價方法?？瞻讓φ战M大鼠功能穩(wěn)定，神經(jīng)功能正常，評分均為21分。致傷后12 h除聯(lián)合治療組可見大鼠出現(xiàn)部分功能恢復(fù)表現(xiàn)外，損傷組、rhEPO組、β-SE組均無明顯功能恢復(fù)。損傷組大鼠傷后功能受損明顯，恢復(fù)緩慢，1 d時僅有1只大鼠有微弱的關(guān)節(jié)活動，至14 d時評分值升至最大，達(dá)8分以上，其中，損傷組BBB運動功能評分均顯著低于rhEPO組、β-SE組和聯(lián)合治療組，差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。聯(lián)合治療組大鼠后肢運動功能恢復(fù)較快，傷后14 d時評分至18分以上，功能基本接近正常。rhEPO組、β-SE組恢復(fù)緩慢，各時間點評分值雖明顯高于損傷組，但均落后于聯(lián)合治療組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉聯(lián)合治療組大鼠的功能恢復(fù)顯著優(yōu)于單組治療。

NF-κB被認(rèn)為是普遍存在于細(xì)胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，它可以被許多刺激劑激活，比如：細(xì)胞因子、氧化劑、病毒、紫外線等。NF-κB活性增高一方面能增加炎癥反應(yīng)的發(fā)生率，另外還會使得機體出現(xiàn)神經(jīng)組織損傷，同時，對于細(xì)胞死亡起到了一定的促進(jìn)作用。本組資料顯示，損傷組傷后4 h NF-κB的表現(xiàn)比較明顯，其中，在14 h出現(xiàn)了最高峰，之后開始出現(xiàn)下降趨勢，在傷后7 d，NF-κB已降低為正常水平。NF-κB表達(dá)比較：聯(lián)合治療組顯著低于損傷組、Rh-EPO組、β-SE組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Rh-EPO組、β-SE組顯著低于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中以8、12 h兩時間點尤為顯著(P<0.01)?？瞻讓φ战M均顯著低于其他四組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。傷后7 d，rhEPO組、β-SE組、聯(lián)合治療組的 NF-κB含量已明顯下降至正常水平。說明，重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉聯(lián)合有助于減少炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)組織損傷，降低細(xì)胞死亡。

Ca2+、Mg2+離子對細(xì)胞的調(diào)控也比其他的離子更具有影響力。Mg2+是細(xì)胞內(nèi)第二種含量豐富的陽離子，SCI后受損微環(huán)境中Ca2+聚集的同時伴有Mg2+流失，SCI后局部Mg2+下降，且下降程度與脊髓組織損傷的程度及SCI后的預(yù)后水平呈正相關(guān)，說明Mg2+下降參與了脊髓損傷過程。Mg2+在細(xì)胞內(nèi)參與多種代謝過程，并是許多酶的活性中心，通過與磷脂形成穩(wěn)定復(fù)合物影響細(xì)胞膜流動性和膜結(jié)合酶的活性。本組資料顯示，鼠脊髓損傷后空白對照組Ca2+含量顯著高于損傷組、rhEPO組、β-SE組及聯(lián)合治療組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組Ca2+含量顯著高于rhEPO組、β-SE組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。空白對照組Mg2+含量顯著低于損傷組、rhEPO組、β-SE組及其聯(lián)合治療組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；另外，rhEPO組、β-SE組，聯(lián)合治療組的Mg2+含量顯著低于損傷組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組的Mg2+含量顯著低于rhEPO組、β-SE組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明，重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉聯(lián)合抑制Ca2+的作用，能起到抑制脊髓組織損傷的效果。

綜上，重組人紅細(xì)胞生成素與β-七葉皂甙鈉聯(lián)合治療有助于改善BBB運動功能評分，促進(jìn)大鼠運動功能恢復(fù)?？梢宰柚咕植緾a2+聚集致超載引起SCI對神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷，阻止Mg2+濃度下降，有效改善局部Ca2+超載以及能量代謝狀態(tài)，延緩神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷的發(fā)展。

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