葉家欣，王世杰，馬丹丹，蔡 遜，張智勇，張建新，田 俊

胃癌的形成和轉(zhuǎn)移涉及到癌基因的激活、抑癌基因的失活及由此引起的各種細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[1-2]。96序列相似的家庭成員B (family with sequence similarity 96, member B, FAM96B)是分子量為18×103的小分子蛋白，其生物學(xué)功能尚不明確[3]。目前研究[4-5]顯示，F(xiàn)AM96B作為潛在抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成。FAM96B在人肝癌、結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，成為癌癥潛在的診斷和治療靶點[6-9]。但是FAM96B在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚未見報道。該研究旨在觀察FAM96B在80例胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異與臨床病理特征的關(guān)系，并探討其對胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集中國人民解放軍武漢總醫(yī)院普通外科2015年7月～2016年7月的80例人胃癌組織及配對癌旁組織標(biāo)本，均置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒及總蛋白抽提試劑盒購自北京Tiangen公司； DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶及MTT均購自日本Sigma公司；FAM96B及β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞凋亡及周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；人胃癌細(xì)胞系SGC7901與pcDNA3.1-myc-FAM96B質(zhì)粒保存于本院中心實驗室。

1.3Westernblot檢測FAM96B蛋白表達(dá)全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。SDS-PAGE電泳分離。PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白電化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。

1.4MTT法檢測SGC7901細(xì)胞活性取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞接種于96孔板,每孔約100 μl，24 h后轉(zhuǎn)染，分為FAM96B組和對照組。DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1～4 d，每孔加MTT和DMSO溶液，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5流式細(xì)胞儀檢測SGC7901細(xì)胞凋亡將細(xì)胞收集后，按照說明書加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，用流式細(xì)胞儀檢測異硫氰基熒光素,利用CellQuest軟件獲取并分析細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1Westernblot檢測結(jié)果FAM96B蛋白在80例新鮮癌旁組織和胃癌組織中的表達(dá)量分別為(1.71±0.29)vs(0.28±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.218，P<0.05)。FAM96B蛋白在癌旁組織中的表達(dá)顯著高于胃癌組織。見圖1。

2.2FAM96B蛋白表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系FAM96B蛋白在胃癌組織中的表達(dá)量以胃癌組織FAM96B條帶的灰度值與對應(yīng)的β-actin的灰度值之比來表示。通過統(tǒng)計分析得：FAM96B蛋白表達(dá)量與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，然而與性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)。見表1。

圖1 Western blot檢測FAM96B在胃癌及癌旁組織中的蛋白表達(dá)

N：癌旁組織；T：胃癌組織；1：泳道1；2：泳道2;與癌旁組織比較：*P<0.05

表1 FAM96B蛋白表達(dá)量與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3MTT法檢測SGC7901細(xì)胞活性FAM96B組吸光度顯著低于對照組(P<0.05)，即過表達(dá)FAM96B可抑制SGC7901細(xì)胞增殖，見圖2。

2.4流式細(xì)胞儀檢測SGC7901細(xì)胞凋亡率過表達(dá)FAM96B組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組[(38.46±1.14)%vs(3.70±0.65)%，t=85.585，P<0.05]，即過表達(dá)FAM96B可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖2 SGC7901細(xì)胞生長曲線與對照組比較：*P<0.05

A：對照組；B：FAM96B組；Q1：機(jī)械性損傷；Q2：晚期凋亡或壞死細(xì)胞；Q3：正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡細(xì)胞

3 討論

胃癌是常見惡性腫瘤之一，5年相對生存率不足20%。因此探討胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的病理生理機(jī)制對于胃癌的防治具有重要的現(xiàn)實意義。越來越多的證據(jù)顯示：FAM96B可能在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，并參與細(xì)胞有絲分裂和凋亡，且與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。但FAM96B與胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系國內(nèi)外未見報道。

在腫瘤組織及其相應(yīng)鄰近正常組織中異常表達(dá)的基因可認(rèn)為是潛在的控制細(xì)胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因。本研究中Western blot檢測結(jié)果證實FAM96B在胃癌組織中的蛋白表達(dá)顯著低于癌旁組織?？梢? FAM96B在具有抑癌基因特性，在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。與張智勇 等[6]、蔡遜 等[7-9]的研究結(jié)果相一致。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一，腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)灶并侵入周圍組織和(或)侵襲血管與淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處組織擴(kuò)散形成新的轉(zhuǎn)移灶，在血供充分的情況下增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。本研究通過對FAM96B蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間關(guān)系的分析，得出FAM96B在胃癌組織中表達(dá)下降與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。提示FAM96B可能是一個與胃癌浸潤及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子指標(biāo)，在胃癌發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中起到一定的抑制作用。

目前，基因克隆、基因轉(zhuǎn)染是明確基因功能的主要方法。為進(jìn)一步研究FAM96B在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能，本研究將FAM96B質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞中，觀察FAM96B基因過表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。本研究中，MTT實驗結(jié)果提示過表達(dá)FAM96B可抑制胃癌細(xì)胞系SGC7901增殖。Ito et al[3]報道FAM96B定位于紡錘體，在染色體正常分離中發(fā)揮作用，F(xiàn)AM96B沉默導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞不能正常有絲分裂，致使異型細(xì)胞核堆積。染色體反復(fù)獲得、缺失或錯誤分離率增加可引起異常的有絲分裂，多核細(xì)胞產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。上述國外研究[3]有力地證實FAM96B與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究中，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示過表達(dá)FAM96B可顯著誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，與國外文獻(xiàn)報道基本一致。

本研究結(jié)果證實：FAM96B作為抑癌基因能夠抑制胃癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡?？赡艹蔀槲赴┰\斷和治療的潛在靶點之一。

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