鄭志明，鄒海鵬，盧敏娟，林碧華，周克元

肝癌主要是臨床上最常見的惡性腫瘤之一[1]。2012年統(tǒng)計(jì)顯示，中國肝癌發(fā)生的病例數(shù)為394 770(占總癌癥發(fā)生病例的12.9%)，死亡病例數(shù)為383 203(占總癌癥死亡病例的17.4%)[2]，顯示出我國肝癌防治形勢的嚴(yán)峻。由于肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，患者確診時(shí)往往已有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移甚至肝外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生[3]，因此，化療在肝癌治療中起著重要作用。常用的肝癌的化療藥有順鉑、阿霉素、絲裂霉素和氟尿嘧啶等，但肝癌是化療藥物敏感性較低，且極易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)肝癌患者的生存預(yù)后受益有限[4]。因此，揭示肝癌耐藥的分子機(jī)制并從中尋找到逆轉(zhuǎn)的方法，成為了近年來肝癌研究的熱點(diǎn)。在此，該文將觀察中藥有效成分佛手柑內(nèi)酯在低濃度下對(duì)肝癌細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)凋亡的影響，并著重分析佛手柑內(nèi)酯對(duì)p62/NF-κB信號(hào)軸的影響。

1 材料與方法

1.1關(guān)鍵試劑及儀器RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液及TRIzol購自美國Invitrogen公司；二甲基乙砜(DMSO, D119415)、佛手柑內(nèi)酯(M101153)、Hoechst33258染料(B113844)及普通化學(xué)試劑購自上海阿拉丁試劑公司；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；p62鼠單抗(66184-1-Ig)、p65兔多抗(10745-1-AP)、α-Tubulin(66031-1-lg)鼠單抗購自美國Proteintech公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗購自美國Merck公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司； Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、pNF-κB-TA-luc質(zhì)粒、pGL6-TA-luc質(zhì)粒、pRL-SV40-C質(zhì)粒及雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀為CFX96、垂直電泳系統(tǒng)、槽式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)及冷凝CCD成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀為Synergy2購自美國BioTek公司；流式細(xì)胞分析儀為FACSCanto II購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞傳代培養(yǎng)及分組人肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2和Bel-7402為廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室長期傳代培養(yǎng)及規(guī)范凍存。HepG2和Bel-7402的培養(yǎng)條件為，含10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定1 μmol/L順鉑對(duì)兩肝癌細(xì)胞的48 h抑制率<50%，1 μmol/L佛手柑內(nèi)酯對(duì)兩肝癌細(xì)胞的48 h抑制率<10%，上述兩濃度可以用于觀察佛手柑內(nèi)酯對(duì)順鉑的增敏作用。因此，實(shí)驗(yàn)組分三組，單用1 μmol/L順鉑(順鉑組)，單用1 μmol/L佛手柑內(nèi)酯(佛手柑內(nèi)酯組)，1 μmol/L順鉑與1 μmol/L佛手柑內(nèi)酯聯(lián)用處理(聯(lián)合組)，對(duì)照組為1% DMSO處理，各組處理時(shí)間均為48 h。

1.3CCK-8測定細(xì)胞活性參考文獻(xiàn)[5]，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，加入終濃度分別在0.1 μmol/L～1 mmol/L間的含順鉑或佛手柑內(nèi)酯培養(yǎng)液正常培養(yǎng)48 h，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入含10 % CCK-8的培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，扣除背景值后以未加藥孔為基準(zhǔn)求算各藥物濃度的抑制率，利用兩點(diǎn)法求算半數(shù)抑制濃度。

1.4凋亡核形態(tài)計(jì)數(shù)分析參考文獻(xiàn)[6]，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，棄除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入0.5 mg/L Hoechest 33258染液避光染色20 min，利用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，每組細(xì)胞在200×視野中隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)：熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核縮小碎裂，呈大小不等的圓形、花瓣?duì)罨虿灰?guī)則塊狀。

1.5AnnexinV-FITC/PI凋亡率檢測參考文獻(xiàn)[5]，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，胰酶消化細(xì)胞后收集，根據(jù)試劑盒提供的說明書操作：離心棄上清液并用PBS洗滌細(xì)胞1次，同前棄盡上清液后，按每1×105細(xì)胞加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC混勻室溫避光孵育10 min。離心棄上清液后，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μl PI染液混勻后冰浴。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞分析儀檢測，調(diào)整并收集每個(gè)樣品的前散射光、側(cè)散射光、Annexin V-FITC和PI四個(gè)通道的信號(hào)，并以前散射光/側(cè)散射光作散點(diǎn)圖圈出主細(xì)胞群，再以Annexin V-FITC/PI對(duì)主細(xì)胞群作圖分出Annexin V-FITC陽性、紅光陰性或陽性的凋亡細(xì)胞群，得到每組細(xì)胞的凋亡率。

1.6熒光定量PCR檢測參考文獻(xiàn)[5]，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入TRIzol室溫裂解，氯仿抽提，離心后吸取上清液至新離心管中，加入異丙11醇沉淀RNA，用含75%乙醇的DEPC水溶洗滌RNA沉淀3次，用DEPC水溶解RNA。測得濃度后按PrimeScript RT reagent Kit說明書操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；按SYBR Premix Ex Taq II Kit說明書操作(引物信息見表1)，在CFX96實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)上，選用2-ΔΔCT相對(duì)定量法進(jìn)行檢測分析，其中選用GAPHD為內(nèi)參基因，求算各目標(biāo)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR檢測所用引物

1.7熒光素酶報(bào)告基因活性檢測參考文獻(xiàn)[6]，將細(xì)胞接種于24孔板中，24 h后換入Opti-MEN培養(yǎng)液。按10 ∶1分別混合pNF-κB-TA-luc或pGL6-TA-luc與pRL-SV40-C，并用Lipofectamine 2000包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。正常培養(yǎng)6 h后，按實(shí)驗(yàn)分組替換為含藥完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培48 h。去除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入裂解液充分裂解細(xì)胞后，離心取上清液轉(zhuǎn)于96孔板，利用Synergy2多功能酶標(biāo)儀的自動(dòng)加樣裝置，按檢測順序自動(dòng)加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑和腎熒光素酶檢測試劑，并以空白孔為參照測定每孔的相對(duì)熒光信號(hào)，按下列公式計(jì)算相對(duì)實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)熒光強(qiáng)度：

1.8Westernblot檢測參考文獻(xiàn)[5]，按實(shí)驗(yàn)分組處理后，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入RIPA裂解液冰上裂解，離心收集上清液，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，向上清液加入5×上樣緩沖液，沸水浴變性蛋白。使用SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)，上樣量為50 μg總蛋白，電泳參數(shù)為10%分離膠、5%濃縮膠，100 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至底部后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，使用0.2 μm的PVDF膜，300 mA冰浴電轉(zhuǎn)90 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，膜使用5%脫脂奶粉封閉，TBST漂洗后，加入稀釋的一抗工作液(按產(chǎn)品說明書稀釋配制)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗后，加入稀釋的二抗工作液(按產(chǎn)品說明書稀釋配制)，室溫孵育1 h，TBST漂洗后，加入ECL發(fā)光液，置壓片夾中用X光片感光，經(jīng)顯影定影后，得到相應(yīng)的Western blot結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1佛手柑內(nèi)酯對(duì)肝癌細(xì)胞的活性抑制利用梯度佛手柑內(nèi)酯處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，利用兩點(diǎn)法求算半數(shù)抑制濃度分別為(194.0 ± 146.7) μmol/L和(331.7 ± 209.7) μmol/L。此外，利用1 μmol/L順鉑處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，兩細(xì)胞的抑制率分別為(69.0±1.5)%和(71.3±1.4)%，均高于90%；利用1 μmol/L佛手柑內(nèi)酯處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，兩細(xì)胞的抑制率分別為(93.4±1.6)%和(94.7±1.0)%，均高于90%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中順鉑與佛手柑內(nèi)酯的濃度均選用1 μmol/L。

2.2佛手柑內(nèi)酯對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡核形態(tài)的影響按實(shí)驗(yàn)分組處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，如圖1所示，相對(duì)于對(duì)照組，順鉑組和佛手柑內(nèi)酯組均能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡核形態(tài)，但順鉑組凋亡核形態(tài)明顯多于佛手柑內(nèi)酯組(P<0.05)；聯(lián)合組中兩肝癌細(xì)胞的凋亡核形態(tài)比順鉑組分別增加1.99倍和2.00倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3佛手柑內(nèi)酯對(duì)凋亡細(xì)胞群的影響按實(shí)驗(yàn)分組處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，如圖2所示，相對(duì)于對(duì)照組，佛手柑內(nèi)酯組和順鉑組中均有肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，但順鉑組凋亡明顯多于佛手柑內(nèi)酯組(P<0.05)；聯(lián)合組中兩肝癌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞群比例比順鉑組分別增加1.86倍和2.00倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4佛手柑內(nèi)酯對(duì)抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響按實(shí)驗(yàn)分組處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，如圖3所示，相對(duì)于對(duì)照組，佛手柑內(nèi)酯組和順鉑組中，BCL2、BCL2L1、XIAP和BIRC5均不同程度地降低，不同藥物對(duì)不同基因的誘導(dǎo)降低效果不一；聯(lián)合組中兩肝癌細(xì)胞的抗凋亡相關(guān)基因的下調(diào)較佛手柑內(nèi)酯組或順鉑組均更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5佛手柑內(nèi)酯對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響按實(shí)驗(yàn)分組處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，如表2所示，相對(duì)于對(duì)照組，佛手柑內(nèi)酯組與順鉑組中，肝癌細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低，且佛手柑內(nèi)酯組NF-κB轉(zhuǎn)錄活性較順鉑組更低(P<0.05)；聯(lián)用組中兩肝癌細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性僅為順鉑組的0.28倍和0.25倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 佛手柑內(nèi)酯對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡核形態(tài)的影響 ×100

圖2 佛手柑內(nèi)酯對(duì)凋亡細(xì)胞群的影響

圖3 佛手柑內(nèi)酯對(duì)抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

A：HepG2細(xì)胞：B：Bel-7402細(xì)胞；1：對(duì)照組；2：佛手柑內(nèi)酯組；3：順鉑組；4：聯(lián)用組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與順鉑組比較：#P<0.05

表2 佛手柑內(nèi)酯對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響(n=3，±s)

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與順鉑組比較：#P<0.05

2.6佛手柑內(nèi)酯對(duì)p62及p65蛋白表達(dá)的影響按實(shí)驗(yàn)分組處理肝癌HepG2和Bel-7402細(xì)胞48 h后，如圖4所示，相對(duì)于對(duì)照組，佛手柑內(nèi)酯組和順鉑組中，p62及p65蛋白表達(dá)水平下調(diào)；聯(lián)合組肝癌細(xì)胞中p62及p65蛋白的表達(dá)水平降低更為顯著。

圖4 佛手柑內(nèi)酯對(duì)p62及p65蛋白表達(dá)的影響

3 討論

佛手柑內(nèi)酯屬于呋喃型香豆素類天然產(chǎn)物，為多種植物的次級(jí)代謝物，更是中藥佛手[7]和當(dāng)歸[8]等的主要有效成分之一，具有抗炎、平喘、鎮(zhèn)靜及催眠等藥理作用[9]。最近的研究顯示，佛手柑內(nèi)酯對(duì)多種惡性腫瘤具有顯著的抑制作用，如乳腺癌[10]及白血病[9]等。本課題組的前期研究[11]也顯示，佛手柑內(nèi)酯對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用，表明佛手柑內(nèi)酯具有一定的抗腫瘤活性，然而佛手柑內(nèi)酯對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效抑制濃度較高，不宜作為單獨(dú)的抗腫瘤藥物開發(fā)。在此，本研究利用低濃度(1 nmol/L)的佛手柑內(nèi)酯與1 nmol/L順鉑聯(lián)用處理肝癌細(xì)胞，顯示其能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力，暗示了低濃度佛手柑內(nèi)酯可以作為化療藥物增敏劑的作用。

大量的研究[12]證實(shí)，炎癥相關(guān)的NF-κB在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并維持異常激活狀態(tài)，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和抗腫瘤治療耐受等密切相關(guān)。靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB二聚體(p50，p65)與細(xì)胞質(zhì)的抑制因子IκBα結(jié)合，以無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外的各種信號(hào)通過級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，使IκB激酶磷酸化IκBα導(dǎo)致IκBα降解而NF-κB恢復(fù)活性的游離狀態(tài)，激活的NF-κB入核與DNA結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13]。在腫瘤細(xì)胞抗化療的機(jī)制中，癌細(xì)胞能通過持續(xù)激活的NF-κB，上調(diào)抗凋亡因子如BCL2、BCL2L2、XIAP和BIRC5等的過量表達(dá)，發(fā)揮促存活作用[12]。本研究顯示，低濃度(1 nmol/L)的佛手柑內(nèi)酯與1 nmol/L順鉑聯(lián)用處理肝癌細(xì)胞，能顯著抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，并降低細(xì)胞中BCL2、BCL2L2、XIAP和BIRC5等的表達(dá)，表明了低濃度的佛手柑內(nèi)酯是通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，降低了抵抗凋亡的多個(gè)基因表達(dá)水平，從而增強(qiáng)順鉑的殺傷作用。

研究[14]顯示，在肝癌組織與細(xì)胞中，NF-κB的持續(xù)性激活可能與多功能蛋白p62的異常高表達(dá)相關(guān)，敲除p62顯著抑制NF-κB的激活。p62是一種多功能泛素結(jié)合蛋白，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起支架和適配的作用，p62分子結(jié)構(gòu)中的多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域可與其它蛋白質(zhì)相互作用，參與泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)兩種蛋白降解過程[15]。研究[15]顯示p62調(diào)控NF-κB主要方式，是通過TB結(jié)構(gòu)域結(jié)合TRAF，形成p62-TRAF6-IKKβ-aPKC 的信號(hào)復(fù)合物激活NF-κB通路；在此通路中，p62與MAPK激酶激酶前端基本區(qū)域MEKK3結(jié)合作為活動(dòng)中心募集TRAF6及其他聚合物，進(jìn)一步促進(jìn)TRAF6的寡聚化及泛素化，最終誘導(dǎo)NF-κB的激活。本研究顯示，低濃度(1 nmol/L)的佛手柑內(nèi)酯與1 nmol/L順鉑聯(lián)用處理肝癌細(xì)胞，能顯著抑制p62蛋白的表達(dá)水平，這可能是NF-κB表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性受抑制的可能機(jī)制。后續(xù)的研究中將進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)揭示，佛手柑內(nèi)酯下調(diào)p62的具體機(jī)制，并通過裸鼠模型，進(jìn)一步探討低濃度佛手柑內(nèi)酯作為化療藥物增敏劑的可能性。

[1] Mazzanti R, Gramantieri L, Bolondi L. Hepatocellular carcinoma: Epidemiology and clinical aspects [J]. Mol Aspects Med, 2008, 29(1-2): 130-43.

[2] Wang D, Li X, Liu J, et al. Effects of TRPC6 on invasibility of low-differentiated prostate cancer cells [J]. Asian Pac J Trop Med, 2014, 7(1): 44-7.

[3] Shin J W, Chung Y H. Molecular targeted therapy for hepatocellular carcinoma: current and future [J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(37): 6144-55.

[4] Lau C K, Yang Z F, Ho D W, et al. An Akt/Hypoxia-inducible factor-1 alpha/Platelet-derived growth factor-BB autocrine loop mediates hypoxia-induced chemoresistance in liver cancer cells and tumorigenic hepatic progenitor cells [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(10): 3462-71.

[5] 張 鑫, 林永文, 鄭愛華, 等. 三七皂苷R1對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 [J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2013, 7(15): 7048-53.

[6] Zhang X, Liu J, Zang D, et al. Upregulation of miR-572 transcriptionally suppresses SOCS1 and p21 and contributes to human ovarian cancer progression [J]. Oncotarget, 2015, 6(17): 15180-93.

[7] 崔紅花, 高幼衡, 蔡鴻飛, 等. 川佛手化學(xué)成分研究(Ⅱ) [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2009, 20(4): 344-7.

[8] 楊秀偉, 王繼彥, 嚴(yán)仲鎧, 等. 四種長白山產(chǎn)當(dāng)歸屬藥用植物的香豆精成分研究 [J]. 中藥材, 1994, 17(4): 30-2,53.

[9] Salvador A, Dall'Acqua S, Sardo M S, et al. Erythroid induction of chronic myelogenous leukemia K562 cells following treatment with a photoproduct derived from the UV-A irradiation of 5-methoxypsoralen [J]. Chem Med Chem, 2010, 5(9): 1506-12.

[10] De Amicis F, Aquila S, Morelli C, et al. Bergapten drives autophagy through the up-regulation of PTEN expression in breast cancer cells [J]. Mol Cancer, 2015, 14: 130.

[11] 林碧華, 馬曉娟, 萬樹偉,等. 佛手柑內(nèi)酯對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 腫瘤防治研究, 2014, 41(11): 1163-70.

[12] Wang W, Nag S A, Zhang R. Targeting the NFκB signaling pathways for breast cancer prevention and therapy [J]. Curr Med Chem, 2015, 22(2): 264-89.

[13] Madonna G, Ullman C D, Gentilcore G, et al. NF-κB as potential target in the treatment of melanoma [J]. J Transl Med, 2012, 10: 53.

[14] Duran A, Hernandez E D, Reina-Campos M, et al. p62/SQSTM1 by binding to Vitamin D receptor inhibits hepatic stellate cell activity, fibrosis, and liver cancer[J]. Cancer Cell, 2016, 30(4): 595-609.

[15] Moscat J, Karin M, Diaz-Meco M T. p62 in cancer: signaling adaptor beyond autophagy [J]. Cell, 2016, 167(3): 606-9.