張阿芳，張 慶，代惠萍，魏樹和，賈根良，吳三橋，魏安智

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué)，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，遼寧 沈陽 110016;4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊陵 712100；5.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

鎘是生物毒性最強的重金屬之一，被列為五大毒物(Cd、Hg、As、Cr、Pb)之首。工業(yè)“三廢”排放、不合理的農(nóng)業(yè)管理措施等是導(dǎo)致土壤Cd污染的主要原因[1-3]。2014年4月17日環(huán)境保護部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布的“全國土壤污染狀況調(diào)查公報”表明，在調(diào)查的630萬km2面積內(nèi)，我國1/5的耕地受到了重金屬污染，其中鎘污染的耕地涉及11個省25個地區(qū)，問題比較突出[3-5]，然而，綜觀現(xiàn)有的重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)，就污染面積較大的農(nóng)田土壤來說，換土或淋洗等物理/化學(xué)修復(fù)方法均因技術(shù)、經(jīng)濟或社會等原因而難以應(yīng)用。利用植物修復(fù)鎘污染土壤，關(guān)鍵是尋找富集能力強的植物，研究其吸收和富集鎘的機制，并在此基礎(chǔ)上改良和培養(yǎng)新的鎘富集植物[6-9]。與草本植物相比，木本植物楊樹具有生長迅速、根系發(fā)達、地上部分生物量大等特點[5,10]。本研究前期表明，銀灰楊(Populuscanescens)是我國新發(fā)現(xiàn)的一種原生態(tài)鎘高積累植物，其對鎘具有很強的耐性和積累能力，是綠色植物修復(fù)技術(shù)的一種良好潛在材料[10]。本研究以銀灰楊為研究對象，初步探討銀灰楊受到鎘脅迫后滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)規(guī)律，為用于受鎘污染土壤的植物修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

本試驗引進德國銀灰楊(Populuscanescens)試管苗，經(jīng)擴繁培養(yǎng)后栽入1/2 Hoagland營養(yǎng)液的塑料盆中，營養(yǎng)液每3 d更換1次，保持pH值為6.5。自然光照下培養(yǎng)2個月時，每盆栽植6株，并加1 000 mL Hoagland無鎘營養(yǎng)液。向盆中營養(yǎng)液加入CdSO4來設(shè)置鎘濃度，形成Cd為0(CK，對照)、10、30、50、70 μmol/L，設(shè)置5個處理，每處理重復(fù)6次，營養(yǎng)液每3 d更換1次。分別在處理7、14、21 d 和28 d時進行收獲，將每株根、葉片分開，迅速用液氮速凍，保存于-80℃冰箱中，進行相關(guān)指標測定。

1.2 丙二醛(MDA)含量和過氧化氫(H2O2)、游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法稍作改進測定丙二醛含量[10]；H2O2含量測定按照代惠萍[10]的方法；脯氨酸含量測定按照李合生[11]等的方法；采用考馬斯亮藍-250蛋白染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量[12]；采用葸酮比色法測定可溶性糖含量[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 16軟件包進行平均數(shù)、方差分析及最小顯著差法(LSD法)差異顯著性比較。試驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘對銀灰楊MDA含量的影響

從表1看出，隨著Cd脅迫時間的延長，銀灰楊根和葉的MDA含量均呈相似增加趨勢，Cd脅迫后7 d時，在10 μmol·L-1脅迫時，葉片和根系MDA含量低于相應(yīng)對照，而30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1脅迫下，MDA含量均比相應(yīng)對照增加；在14～21 d時，不同脅迫下葉片和根系的MDA含量均顯著高于對照(P<0.05)；隨著滲透脅迫程度的加重，到第28天時，在10、30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫下，葉和根系的MDA含量分別高于相應(yīng)對照10.9%、47.3%、1.05倍、1.33倍和 95.8%、1.01倍、1.96倍和 2.82倍；進一步表明鎘毒害引起銀灰楊體內(nèi)產(chǎn)生了氧化脅迫，銀灰楊根系和葉片氧化損傷程度與鎘濃度成正相關(guān)。

2.2 鎘對銀灰楊H2O2含量的影響

表2可知，隨著鎘脅迫時間的延長，銀灰楊葉片和根系的H2O2含量均呈相似增加趨勢，在7 d和14 d時，10 μmol·L-1和30 μmol·L-1Cd脅迫下葉片和根系H2O2含量均稍低于相應(yīng)對照，而50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫下H2O2含量均稍高于相應(yīng)對照，且差異不顯著(P<0.05)；在21 d時，隨著Cd濃度葉片和根系的H2O2含量而增加，且差異顯著(P<0.05)；在10、30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫28 d時，葉片和根系H2O2含量均高于相應(yīng)對照9.0%、52.6%、62.8%、75.6%和14.6%、56.2%、91.0%、1.03倍。

2.3 鎘對銀灰楊脯氨酸含量的影響

從圖1可以看出，隨著Cd濃度增加，銀灰楊葉片和根系的脯氨酸含量均呈相似增加趨勢。在7 d到21 d時，在10 μM Cd脅迫7 d時，葉片的脯氨酸含量比對照減少了0.7%，且不同濃度鎘脅迫下葉片和根系脯氨酸含量差異顯著(P<0.05)；隨著滲透脅迫程度的加重，在10、30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫28 d時，葉片和根系脯氨酸含量分別高于相應(yīng)對照11.7%、41.8%、80.4%、117.4%和3.2%、18.4%、80.0%和142.7%。

2.4 鎘對銀灰楊可溶性蛋白含量的影響

圖2表明，隨著鎘脅迫時間的延長，銀灰楊的葉片和根中可溶性蛋白含量總體呈增加趨勢。在7～21 d時，不同濃度鎘脅迫下，葉片和根系可溶性蛋白含量均高于對照，且差異顯著(P<0.05)；在10、30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫28 d時，葉片和根系可溶性蛋白含量均高于相應(yīng)對照4.2%、8.7%、13.9%、10.0%和8.5%、19.8%、23.5%、2.8%，且差異顯著(P<0.05)。

表1 Cd脅迫對銀灰楊葉片和根系MDA含量的影響

注：數(shù)據(jù)顯示為平均值±SE(n=6)，不同字母表示P<0.05顯著水平。下同。

表2 Cd脅迫對銀灰楊葉片和根系H2O2含量的影響

圖1 Cd脅迫對銀灰楊脯氨酸含量的影響

圖2 Cd脅迫對銀灰楊可溶性蛋白含量的影響

2.5 鎘對銀灰楊可溶性糖含量的影響

從圖3可知，隨著鎘脅迫時間的延長，銀灰楊的葉片和根系中可溶性糖含量均呈增加趨勢。在7～21 d時，不同濃度鎘脅迫下葉片和根系的可溶性糖濃度均高于相應(yīng)對照，在28 d時，在10、30、50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫下，葉片和根系的可溶性糖分別比對照增加了49.6%、50.4%、74.3%、96.5%和78.7%、90.7%、67.3%、51.9%，且不同濃度間差異顯著(P<0.05)。

圖3 Cd脅迫對銀灰楊葉片和根系中可溶性糖含量的影響

3 結(jié)論與討論

鎘脅迫條件下，因在植物體內(nèi)過量的ROS積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，且使蛋白質(zhì)脫氫而產(chǎn)生蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)發(fā)生鏈式聚合反應(yīng)，從而使細胞膜系統(tǒng)損傷[13-17]。因此，H2O2和MDA含量是衡量氧化脅迫程度的重要指標[13]。本研究中，在低濃度10 μmol·L-1Cd脅迫7 d，葉片和根系的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和H2O2的含量均稍低于相應(yīng)的對照，說明在低濃度鎘條件下，銀灰楊體內(nèi)清除過量自由基防止過氧化方面發(fā)揮重要作用。且隨著鎘脅迫程度的加劇，在28 d時，50 μmol·L-1和70 μmol·L-1Cd脅迫下，其根系和葉片H2O2和MDA含量顯著增加，這說明Cd毒害引起銀灰楊產(chǎn)生了氧化脅迫，氧化損傷隨Cd脅迫濃度的增加而加強。本試驗進一步證實了Chao[18]等的結(jié)果。

可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，三者在逆境脅迫下，植物體以保持植物細胞的含水量和膨壓勢，維持植物的正常生長和代謝[8]。植物在重金屬脅迫下，細胞中可溶性蛋白質(zhì)含量的增加，一方面可與Cd2+形成Cd結(jié)合蛋白(Cd-BP)，Cd-Bp的形成限制了自由態(tài)Cd2+的存在，減輕了Cd對植物的毒害；另一方面可提高功能蛋白的數(shù)量，增加細胞滲透勢，有助于維持細胞正常代謝，提高植物的抗逆性[14]。在本研究中，隨Cd濃度增加，當(dāng)銀灰楊受到鎘脅迫時，通過提高可溶性蛋白和可溶性糖的積累量來降低細胞免受傷害，維持細胞正常的生理代謝。說明銀灰楊體內(nèi)可能存在解毒作用的特定蛋白，這是銀灰楊耐Cd毒害的一種解毒機制。本研究結(jié)果與苧麻[19]的研究結(jié)果相一致。

脯氨酸是PCs合成前體，也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在Cd脅迫下，脯氨酸含量的提高有著對逆境適應(yīng)的意義。鎘脅迫28 d時，隨著滲透脅迫程度的加重，銀灰楊體內(nèi)的脯氨酸含量呈上升趨勢，表明鎘脅迫條件下銀灰楊體內(nèi)脯氨酸含量的上升可視為植物的保護性反應(yīng)，且認為脯氨酸含量的提高可能是銀灰楊耐Cd機制之一。本研究結(jié)果與歐洲黑楊[20]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，銀灰楊具有一定的耐鎘性，低濃度的鎘(10 μmol·L-1)脅迫對銀灰楊幼苗生長的影響較小，而當(dāng)鎘脅迫濃度為70 μmol·L-1時會對銀灰楊幼苗產(chǎn)生一定的毒害作用，通過主動積累脯氨酸、蛋白質(zhì)和可溶性糖等滲透物質(zhì)來維持自身體內(nèi)的水分平衡和滲透平衡，以降低其毒害作用。鎘脅迫會對銀灰楊的抗逆性生理特性產(chǎn)生一定的影響，其自身產(chǎn)生的適應(yīng)性生理響應(yīng)可能是其緩解鎘毒害的一種調(diào)節(jié)機制。

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