熊雄，易書瀚，趙紫薇，成煥，吳忠坤，郭亦晨，李珂,2,3，王遠(yuǎn)亮,2,3

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.海南聯(lián)合檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南 ?？?570100

檳榔作為現(xiàn)代社會(huì)一種快速消費(fèi)品正逐漸被大眾所接受，并成增長(zhǎng)趨勢(shì)。首先，檳榔中含有檳榔堿、檳榔次堿等重要的生物堿，這些生物堿對(duì)人體口腔均有不同程度的毒性作用，長(zhǎng)時(shí)間咀嚼檳榔還能導(dǎo)致口腔黏膜下纖維性變(OSF)及口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)[1-3]。因此咀嚼檳榔大多數(shù)都是對(duì)口腔具有毒性作用。事實(shí)上，一個(gè)健康人口腔中含有億萬(wàn)多的微生物，這其中絕大多數(shù)都是口腔菌群的正常微生物群落，當(dāng)口腔過(guò)量咀嚼檳榔時(shí)，口腔黏膜組織會(huì)被破壞，這可能是咀嚼檳榔時(shí)口腔過(guò)度用力，導(dǎo)致檳榔殘?jiān)S同牙齒在口腔中來(lái)回摩擦，進(jìn)而刺激口腔黏膜，造成口腔機(jī)械性物理?yè)p傷。研究咀嚼檳榔對(duì)口腔造成的不可逆?zhèn)κ强谇晃⑸锒鄻有苑治龅闹匾獌?nèi)容，這對(duì)防治口腔疾病有著重要作用。隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步，利用分子生物學(xué)研究口腔微生物多樣性已然成為當(dāng)下趨勢(shì)，相比傳統(tǒng)的16S rDNA方法，高通量測(cè)序技術(shù)具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)。本研究利用高通量測(cè)序方法對(duì)健康人咀嚼檳榔前后的唾液進(jìn)行對(duì)比分析來(lái)探討口腔微生物菌群結(jié)構(gòu)分布及微生物群落多樣性，以期為食用檳榔與口腔微生態(tài)相關(guān)性研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1檳榔 選自湖南某檳榔制造企業(yè)市售食用成品檳榔。

1.1.2健康人選取標(biāo)準(zhǔn) 從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院選取8個(gè)健康成年人，年齡21～25周歲，被選者3個(gè)月內(nèi)無(wú)注射或服用抗生素，無(wú)吸煙，無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，無(wú)口腔潰瘍，無(wú)進(jìn)行口腔局部創(chuàng)傷手術(shù)，8人在此之前均無(wú)咀嚼過(guò)檳榔。

1.1.3健康人咀嚼檳榔前后唾液樣本收集 采集咀嚼檳榔前的唾液樣品，8名入選者用0.85%無(wú)菌生理鹽水輕輕漱口1～2 min，采集自然排出的唾液2 mL，標(biāo)記為Qa、Qb、Qc、Qd、Qe、Qf、Qg、Qh，記為Q組。同樣，采集咀嚼檳榔后的唾液樣品，入選者輕輕漱口1～2 min，然后咀嚼半顆檳榔(7～10 g)，直至無(wú)甜味，檳榔殘?jiān)势屏牙w維狀，采集自然排出的唾液2 mL，對(duì)同一個(gè)體咀嚼5 min后、吐出檳榔后30 min采集唾液，分別標(biāo)記為Ha5、Ha30、Hb5、Hb30、Hc5、Hc30、Hd5、Hd30、He5、He30、Hf5、Hf30、Hg5、Hg30、 Hh5、Hh30，記為H5組、H30組。所有采集的唾液均在-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增 各樣品DNA的提取采用GV-Bacterial Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性、純度、片段大小和濃度。通過(guò)參考Walter等文獻(xiàn)，采用口腔微生物16S rDNA通用引物HAD-1/HAD-2擴(kuò)增V4區(qū)。50 μL PCR體系擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min預(yù)變性；98℃ 10 s，46℃ 15 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。提取質(zhì)量合格的DNA樣品，將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行口腔微生物16S rDNA V4區(qū)HiSeq2500 PE250測(cè)序平臺(tái)的高通量測(cè)序。

1.2.2數(shù)據(jù)分析 利用Uparse軟件[5]對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA[6]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[7]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，分別在界、門、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE[8]軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。另外，使用Qiime軟件計(jì)算物種數(shù)(Observed-species)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)、辛普森指數(shù)(Simpson′ index)、ACE指數(shù)、深度測(cè)序指數(shù)(Good′s coverage)。

2 結(jié) 果

2.1基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增 全部樣品基因組經(jīng)過(guò)DNA提取后，所有樣品均在200 bp左右，條帶均清晰可見，滿足后續(xù)測(cè)序需要，見圖1。

注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，1：Qa，2：Ha5，3：Ha30，4：Qb，5：Hb5，6：Hb30，7：Qc，8：Hc5，9：Hc30，10：Qd，11：Hd5，12：Hd30，13：Qe，14：He5，15：He30，16：Qf，17：Hf5，18：Hf30，19：Qg，20：Hg5，21：Hg30，22：Qh，23：Hh5，24：Hh30。

圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2基因組菌群測(cè)序結(jié)果分析 所有樣品的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rDNA V4區(qū)后進(jìn)行高通量測(cè)序，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析獲得序列的alpha多樣性。所有組別樣品的測(cè)序覆蓋率均在97%以上，表明樣品中序列未被測(cè)到的概率低，見表1。

細(xì)菌群落豐富度用Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表示，其值越高表明群落物種的豐富度越高；細(xì)菌群落多樣性程度用香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)和辛普森指數(shù)(Simpson′ index)表示，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越高。在所有樣品組別中，相對(duì)于咀嚼檳榔前的口腔微生物多樣性，咀嚼檳榔5 min及30 min后，被發(fā)現(xiàn)的物種逐漸增多，ACE和Chao1指數(shù)降低，表明樣品中菌群相對(duì)豐度降低。而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高，表明菌群的多樣性高。

表1 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后口腔微生物菌群的alpha多樣性比較

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

2.3細(xì)菌基因組菌群多樣性分析

2.3.1基于門水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析 用Mothur方法與SILVA 的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，獲得分類學(xué)信息中門水平的群落組成，見表2。在咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后，所有樣品中的總細(xì)菌菌群相對(duì)豐度大于1%的菌門主要包含變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)，見圖2。咀嚼檳榔前的平均相對(duì)豐度分別為31.0%、32.9%、17.2%、5.4%、3.7%、1.9%、2.2%，咀嚼5 min后分別為31.2%、32.2%、15.2%、4.6%、5.3%、2.2%、2.5%，咀嚼30 min后分別為34.7%、29.0%、14.0%、5.2%、5.2%、2.4%、2.5%。不同個(gè)體在門水平上的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果還包括少量的酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)等。

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

圖2 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后菌群在門水平上的相對(duì)豐度分布圖

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

2.3.2基于屬水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析 基于宏基因組DNA測(cè)序的結(jié)果顯示，在Q組、H5組和H30組中，相對(duì)豐度較大菌群在屬水平上的分布見圖3。鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)相對(duì)豐度均大于5%，為主要菌群。而口腔微生物的30種核心菌屬在3個(gè)樣品組均有分布，分別占總量的62.93%、57.78%、58.77%。

在咀嚼檳榔前，口腔內(nèi)菌群相對(duì)豐度大于1%菌屬的有鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思氏菌屬(Rothia)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、兼性雙球菌屬(Gemella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)，占總量的52.98%，其中鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)的相對(duì)豐度最大。在咀嚼5 min后，上述這14種相對(duì)豐度較大的菌屬中，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)和兼性雙球菌屬(Gemella)相對(duì)豐度均小于1%，其余菌屬均大于1%。在咀嚼30 min后，兼性雙球菌屬(Gemella)均相對(duì)豐度小于1%，其余菌屬均大于1%。而乳球菌屬(Lactococcus)、加德納菌屬(Gardnerella)在咀嚼檳榔前未被檢出，見表3。

在咀嚼5 min后，鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、普雷沃菌_6屬(Prevotella_6)、兼性雙球菌屬(Gemella)的相對(duì)豐度均降低，而奈瑟菌屬(Neisseria)、羅思菌屬(Rothia)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)的相對(duì)豐度均增大。在咀嚼30 min后，纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思菌屬(Rothia)的相對(duì)豐度均增大。

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

圖3 咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后菌群在屬水平上的相對(duì)豐度分布圖

注：Q組：咀嚼檳榔前，H5組：咀嚼5 min后，H30組：吐出檳榔，咀嚼30 min后。

3 討 論

3.1咀嚼檳榔前后口腔微生態(tài)研究 本研究通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)8名健康成年人在咀嚼檳榔前、咀嚼5 min后和咀嚼30 min后的唾液進(jìn)行對(duì)比分析，來(lái)探討口腔微生物菌群結(jié)構(gòu)分布及微生物群落多樣性。研究結(jié)果表明，在已知檢出的高豐度菌群中，大部分菌群在咀嚼檳榔5 min后較咀嚼前微生物群落多樣性降低，包括鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、兼性雙球菌屬(Gemella)。而在咀嚼5 min后，吐出檳榔，30 min后，少數(shù)菌群如纖毛菌屬(Leptotrichia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、梅毒螺旋體_2(Treponema_2)、羅思菌屬(Rothia)微生物群落多樣性增大。特別地，鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮球菌屬(Veillonella)作為主要變化的菌屬在咀嚼檳榔的過(guò)程中，對(duì)口腔產(chǎn)生一定的作用，可能是口腔齲齒等牙周疾病的直接或間接影響因子，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

人口腔在咀嚼檳榔5 min后，口腔快速與檳榔進(jìn)行互相作用，檳榔中的檳榔堿、檳榔次堿等生物堿發(fā)揮一定的毒性作用，表現(xiàn)在明顯的抑菌方面，導(dǎo)致菌群數(shù)量減少[9]。此外，附著在口腔內(nèi)壁上的正常菌群由于口腔咀嚼機(jī)械性運(yùn)動(dòng)，口腔內(nèi)壁不斷與檳榔進(jìn)行摩擦，這也可能是導(dǎo)致大部分菌群數(shù)量減少的原因。而當(dāng)咀嚼5 min后，吐出檳榔，30 min后，口腔中沒有進(jìn)行任何咀嚼活動(dòng)及進(jìn)食，口腔內(nèi)大部分菌群數(shù)量明顯增多，口腔重回內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。乳球菌屬(Lactococcus)和加德納菌屬(Gardnerella)在咀嚼5 min后檢出，這可能是檳榔本身帶入的外源性菌屬。而鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌_7屬(Prevotella_7)、韋榮球菌屬(Veillonella)、奈瑟菌屬(Neisseria)成為主要變化的菌屬，作為口腔微生物的重要成員，其自身的存在是口腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。這些菌群呈高豐度分布，維持著微生物之間及微生物與宿主之間相互作用。

3.2咀嚼檳榔對(duì)口腔及口腔菌群關(guān)系的影響 在咀嚼檳榔時(shí)，牙齒接受檳榔的不斷往復(fù)摩擦，牙床松動(dòng)，牙齦紅腫，導(dǎo)致牙周炎癥。鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)作為齲齒、牙周炎等口腔疾病的參與者，發(fā)揮了重要的作用。在中國(guó)，食用檳榔是經(jīng)過(guò)檳榔鮮果加工而產(chǎn)生的一種咀嚼食品，具有高甜度的特點(diǎn)。當(dāng)短時(shí)接觸高甜度食品，口腔中微生物產(chǎn)酸能力增大，正常情況下，口腔唾液具有緩沖作用，產(chǎn)酸耐酸菌群的產(chǎn)酸能力超過(guò)唾液緩沖能力后，牙菌斑中對(duì)酸性環(huán)境敏感的菌群生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)酸耐酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌種，最終出現(xiàn)齲齒[10-11]。鏈球菌屬(Streptococcus)是齲齒患者口腔中的優(yōu)勢(shì)菌，尤其是產(chǎn)酸鏈球菌在齲齒患者口腔中分布更多[12-13]。韋榮球菌屬(Veillonella)作為齲齒活動(dòng)口腔中的高豐度分布菌屬，其豐度及多樣性也影響口腔健康[14]。韋榮球菌屬(Veillonella)不能直接代謝糖類產(chǎn)酸，但它能利用鏈球菌屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物如琥珀酸、丙酮酸、乳酸等作為營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源[15]，這也提示鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)作為協(xié)同菌在齲齒等牙周疾病中發(fā)揮了重要作用，但兩者協(xié)同的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。此外，增大樣本量也是下一步研究開展的關(guān)鍵步驟，由于個(gè)體差異性，不同個(gè)體的口腔健康情況直接影響研究的進(jìn)行，因此，排除個(gè)體差異性同樣重要。

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