王艷萍， 徐倩倩， 郭時(shí)金， 張 穎， 董 林， 楊麗梅， 馬 力， 沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院， 山東 濱州 256600 ；2.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東 濱州 256600 ；3.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司， 山東 濱州 256600)

大腸桿菌感染可引起畜禽流行性大腸桿菌病，嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，與此同時(shí)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷發(fā)展壯大，以及新舊動(dòng)能轉(zhuǎn)換趨勢(shì)的發(fā)展，中獸藥代替抗生素的趨勢(shì)越來越迫切了。

中華醫(yī)藥博大精深，它是以整體觀念和辯證論治為核心的獨(dú)特醫(yī)學(xué)科學(xué)體系，是中華民族優(yōu)秀文化寶庫中的一支奇葩。 中獸藥是中獸醫(yī)學(xué)防治畜禽疾病的重要手段，中獸藥的配伍與禁忌是提高其臨床療效，保證用藥安全的重要環(huán)節(jié)。 中獸醫(yī)藥因具備多種有效成分、無殘留、多作用靶位、作用范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)而成為新型抗菌藥物及抗菌藥物增效劑的篩選靶點(diǎn)之一[1]。

為尋找抗雞大腸桿菌的中獸藥，本試驗(yàn)以黃連-紫花地丁、黃連-蘆丁、黃連-雙花連翹3 對(duì)中藥對(duì)大腸桿菌的抑制為研究對(duì)象，通過微量棋盤法篩選最佳配比，以期達(dá)到合理用藥、節(jié)約用藥的目的，為中獸藥發(fā)展做出奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥材 黃連、紫花地丁、蘆薈，均購自安國伊康藥業(yè)有限公司；雙花連翹提取物，購自四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司；0.5 麥?zhǔn)媳葷峁?、MHB、MHA培養(yǎng)基等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 菌株 大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)菌株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈(zèng)。

1.3 儀器 ST16R 離心機(jī)，美國ThermoFisher ST 16R；RE-52AAA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海嘉鵬科技有限公司；SH-B 95A 型循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式小型離心機(jī)，Sigma 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥物的提取及濃縮 稱取30 g 黃連，粉碎，后加入10 倍、8 倍、8 倍水，煎煮提取3 次，每次2 h，3 000r/min 離心10 min，-0.1 Mpa 濃縮；稱取20 g 紫花地丁，加入0.8 L 水冷凝回流煮沸1 h，再加入0.4 L 水冷凝回流煮沸1 h，3 000 r/min 離心10 min，-0.1 Mpa濃縮至1 g/mL；稱取20 g 蘆薈，加入40 mL水加熱使溶解，3 000 r/min 離心10 min，-0.1 Mpa濃縮至0.5 g/mL。

1.4.2 制備大腸桿菌菌液 將大腸桿菌O2菌株，挑取平板上的單菌落，接種至肉湯培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)，稀釋至每毫升含細(xì)菌1.5 ×105CFU。

1.4.3 黃連、紫花地丁、蘆薈和雙花連翹最低抑菌濃度的檢測(cè) 以微量稀釋法(microdilution)進(jìn)行：取U 形底96 孔板，在第1 -9 孔中每孔加入MH 肉湯50 μL，第1 孔加入藥物原液50 μL，混合均勻后，依次倍比稀釋至第9 孔，自第9 孔中吸取50 μL棄去。第10 孔加入MH 肉湯100 μL 作為空白對(duì)照，第11孔加入藥物原液100 μL 作為藥物對(duì)照，第12 孔為菌液對(duì)照(加入MH 肉湯50 μL)；在第1 孔至9 孔和12 孔各加入以上制備好的菌液50 μL；加完液后蓋上蓋，振蕩混勻，置入墊有濕潤紗布的方形盤內(nèi)，于36 ℃培養(yǎng)18 h ～24 h 后，觀察結(jié)果。1.4.4 黃連-紫花地丁、黃連-蘆薈、黃連-雙花連翹聯(lián)合抑菌效果的測(cè)定 微量棋盤稀釋法，基本方法同微量稀釋法。 用滅菌后的96 孔微孔板，在第1 ～6 行沿X 軸方向(從左到右)每孔中依次加入：MHB，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC 的黃連藥液各25 μL，以同樣的方法在第A-F 列沿Y 軸方向(從上到下) 每孔中依次加入8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC 的紫花地丁(蘆薈或雙花連翹提取物)提取物液、MHB 各25 μL，將兩藥混合均勻。 然后加入制備好的菌液50 μL，使最終抗菌藥物濃度與計(jì)劃稀釋度相同，加液完畢，蓋上蓋，振蕩混勻，放入墊有濕紗布的方盤內(nèi)，36 ℃培養(yǎng)18 h ～24 h，觀察結(jié)果。 棋盤稀釋法藥物加入方法按表2，并設(shè)立平行樣。 兩種藥物組合后每孔的最終濃度則為原藥物濃度的1/4。 加液完畢后放入36.5 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18 h。

表1 微量稀釋法藥物加入方法

表2 棋盤稀釋法藥物加入法

1.4.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 用消毒棉簽將U 型底96孔聚乙烯微孔板的每孔培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至MHA 平板，置于36.5 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)菌生長情況。

2 結(jié)果

2.1 黃連、紫花地丁、蘆薈、雙花連翹提取結(jié)果 黃連、紫花地丁、蘆薈、雙花連翹的終濃度分別為1.0 g/mL、1.0 g/mL、0.5 g/mL 和10 g/mL。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

2.2.1 單獨(dú)用藥時(shí)黃連MIC 為(1/8 原液濃度)，紫花地丁MIC 為1/4 原液濃度，蘆薈MIC 為原液濃度，雙花連翹MIC 為1/4 原液濃度。

2.2.2 聯(lián)合抑菌效果 黃連與紫花地丁聯(lián)用時(shí)，黃連的MIC(聯(lián)) =1/16 原液，紫花地丁聯(lián)用時(shí)的MIC(聯(lián)) =1/64 原液；黃連與蘆薈聯(lián)用時(shí)，黃連的MIC為1/128 原液，蘆薈的MIC(聯(lián)) =1/8 原液；黃連與雙花連翹聯(lián)用時(shí)，黃連的MIC 為1/64 原液，雙花連翹(聯(lián))聯(lián)用時(shí)的MIC(聯(lián))為1/16 原液。

2.2.3 聯(lián)合抑菌FIC FIC(黃連-紫花地丁) =黃連聯(lián)用時(shí)的MIC/黃連單測(cè)時(shí)的MIC+紫花地丁聯(lián)用時(shí)的MIC/紫花地丁單用時(shí)的MIC =(1/16 原液)/(1/8 原液) +(1/64 原液)/(1/4 原液) =1/2+1/8 =0.625，0.5 ＜0.625 ＜1，二者表現(xiàn)為相加作用。

FIC(黃連- 蘆薈) = 黃連聯(lián)用時(shí)的MIC/黃連單測(cè)時(shí)的MIC+蘆薈聯(lián)用時(shí)的MIC/蘆薈單用時(shí)的MIC= (1/128 原液)/(1/8 原液) + (1/8 原液)/(1/4 原液) =1/16 +1/2 =0.5625，0.5 ＜0.5625 ＜1，二者表現(xiàn)為相加作用。

FIC 黃連-雙花連翹=黃連聯(lián)用時(shí)的MIC/黃連單測(cè)時(shí)的MIC +雙花連翹聯(lián)用時(shí)的MIC/雙花連翹單用時(shí)的MIC =(1/64 原液)/(1/8 原液) +(1/16 原液)/(1/4 原液) =1/8 +1/4 =0.375，0.375 ＜0.5，二者表現(xiàn)為協(xié)同作用。

3 結(jié)論

黃連與紫花地丁聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)為相加作用；黃連與蘆薈聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)為相加作用；黃連與雙花連翹提取物聯(lián)用時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。

4 結(jié)果分析與討論

由于中藥成分復(fù)雜，不同中藥提取物抗菌活性不同，作用機(jī)理不同于抗生素，療效往往受中藥各成分間的協(xié)同和綜合作用影響[2-4]。

關(guān)于黃連與紫花地丁、黃連與蘆薈、黃連與雙花連翹這3 對(duì)中藥對(duì)聯(lián)合抑菌試驗(yàn)均未見相關(guān)報(bào)道。 由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，黃連單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，最低抑菌濃度為1/8 原液，紫花地丁單獨(dú)用藥時(shí)，抑菌濃度為1/4 原液，當(dāng)二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，黃連抑菌濃度降為單用時(shí)的1/2，紫花地丁抑菌濃度降為單用時(shí)的1/12，F(xiàn)IC=0.625，表現(xiàn)為相加作用；蘆薈單用時(shí)的MIC 為原液，與黃連聯(lián)用時(shí)，最低抑菌濃度為1/8 原液，降為原來的1/8，并且使黃連最低抑菌濃度降為原來的1/16，F(xiàn)IC =0.562 5，表現(xiàn)為相加作用；雙花連翹單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，最低抑菌濃度為1/4 原液，與黃連聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，最低抑菌濃度降為原來的1/4，使黃連的抑菌濃度降為原來的1/8，F(xiàn)IC =0.375，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

說明黃連與紫花地丁聯(lián)合應(yīng)用后，抑菌效果明顯增強(qiáng)，目前尚未見到黃連和雙花連翹提取物聯(lián)合抑菌方面的報(bào)道，為黃連和紫花地丁的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。