徐曉薇，李芝佳，王寶利△

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的細胞，最早從骨髓中獲得并作為造血干細胞的滋養(yǎng)層細胞，后被發(fā)現(xiàn)其在不同的誘導條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及肌細胞等［1］。microRNAs（miRNAs）是一類在真核細胞中調(diào)控基因表達的小分子非編碼RNA，通過阻礙翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后可對靶基因發(fā)揮抑制作用［2］。miRNAs參與了脂肪細胞生成和代謝過程調(diào)控，如miR125b-5p在脂肪生成過程中表達量會上升［3］；miR-130可通過抑制特定脂肪生成因子的mRNA表達，從而抑制脂肪生成過程［4］；miR-146a在人類脂肪細胞中可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［5］等。但目前關(guān)于miR-301b對脂肪細胞分化的調(diào)控研究尚少見。本實驗通過將miR-301b mimics轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)細胞ST2，旨在探討miR-301b對MSCs向脂肪細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 骨髓基質(zhì)細胞系ST2細胞為本實驗室保存；胎牛血清及細胞培養(yǎng)基均購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNA iMAX購自美國Invitrogen公司；miR-301b mimics及其陰性對照片段（NC）由上海吉瑪生物科技公司合成；miRNA提取試劑盒及總RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRNA特異性引物購自Gene Copoeia公司，高效逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；SYBR Green qPCR Kit購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鼠源β-actin單克隆抗體、兔源過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）多克隆抗體和兔源脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（aP2）單克隆抗體均購自proteintech公司；兔源C/EBPα單克隆抗體購自ABGENT公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ST2細胞的培養(yǎng)、分組與誘導分化 間充質(zhì)干細胞系ST2于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素、鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基。當細胞匯合度達到100%時，將細胞分為成脂分化誘導組和對照組，成脂分化誘導組的細胞換用含有0.05 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 mg/L胰島素、0.05 mmol/L吲哚美辛、0.05μmol/L地塞米松和10%FBS的α-MEM成脂誘導培養(yǎng)基，促使ST2細胞向成脂方向分化。

1.2.2 ST2細胞成脂誘導后miR-301b表達量的檢測 ST2細胞成脂誘導24 h后收集細胞，使用OMEGA miRNA kit提取細胞miRNA，cDNA的逆轉(zhuǎn)錄使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行。用SYBR Green qPCR試劑分別進行miR-301b和U6（內(nèi)參）的qRT-PCR擴增。miR-301b上游引物5′-TGCAATGGTATTGTCAAAGC-3′，U6 上游引物 5′-TTCGTGAAGCGTTCCATATT-3′；下游均使用試劑盒自帶通用引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。PCR反應(yīng)體系：cDNA 3μL，上、下游引物（10μmol/L）各 0.75μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 7.5μL，去離子水補充至15μL。反應(yīng)條件：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，57℃退火15 s，72℃延伸15 s，40個循環(huán)。目的基因在成脂分化誘導組中相對于對照組的表達量變化采用2-ΔΔCt法計算，其中ΔCt=目的基因Ct值–U6 Ct值，ΔΔCt=成脂分化誘導組ΔCt值–對照組ΔCt值，表達量變化倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.2.3 ST2細胞的轉(zhuǎn)染與分組 實驗前將ST2細胞接種于12孔板中，待細胞匯合度達到 40%～50%時，按照Lipofectamine RNA iMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書，將細胞分為miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組和NC轉(zhuǎn)染組，分別轉(zhuǎn)染miR-301b mimics和NC，其中miR-301b mimics和NC的終濃度均為30 nmol/L。轉(zhuǎn)染20 h后更換細胞培養(yǎng)基，并在細胞匯合度達到100%時按方法1.2.1誘導細胞成脂分化。

1.2.4 qRT-PCR檢測脂肪細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和標志基因的表達 收取分組轉(zhuǎn)染并經(jīng)成脂誘導48 h的ST2細胞，利用OMEGA總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，并取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄過程使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。PPARγ、C/EBPα和aP2的引物設(shè)計使用primer 5軟件，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同

1.2.2 。各實驗組目的基因的表達量相對于對照組的表達量變化倍數(shù)用2-ΔΔCt法計算，其中各實驗組ΔCt=目的基因Ct值-β-actin Ct值，ΔΔCt=miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組 ΔCt值–NC 轉(zhuǎn)染組 ΔCt值，表達量變化倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.2.5 Western blot檢測細胞成脂特異性蛋白的表達 收取miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組和NC轉(zhuǎn)染組的經(jīng)成脂誘導分化72 h后的ST2細胞，加入適量蛋白裂解液置于冰上裂解10 min，經(jīng)12 000×g離心10 min，棄去細胞碎片沉淀，含蛋白上清使用BCA方法測定蛋白濃度。取各組蛋白各20μg，加入5×SDS Loading Buffer并煮沸充分變性，進行10%SDS-PAGE電泳。凝膠中的蛋白經(jīng)250 mA恒流轉(zhuǎn)膜110 min后轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用脫脂奶粉封閉2 h，后加入一抗（稀釋比：鼠抗β-actin 單克隆抗體為 1∶5 000，兔抗 PPARγ 為 1∶1 500、C/EBPα 為 1∶500，aP2為 1∶1 500）孵育過夜。次日 NC 膜使用1×PBST洗滌3次，每次10 min，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比：山羊抗鼠 IgG 1∶5 000，山羊抗兔 IgG 1∶2 000）孵育2 h，再經(jīng)1×PBST洗滌5次，每次8 min，最后采用ECL化學發(fā)光試劑檢測蛋白印跡結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。2 組間均數(shù)進行比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-301b在小鼠ST2細胞成脂誘導分化過程中的表達變化 成脂分化誘導組miR-301b相對表達水平（0.219±0.021）較對照組（1.000±0.425）減少（t=3.177，n=3，P＜0.05）。

2.2 miR-301b對細胞成脂特異性基因表達的影響 miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組的PPARγ、C/EBPα和aP2相對表達量均較NC轉(zhuǎn)染組降低（P＜0.05），見表2。

2.3 miR-301b對細胞成脂特異性蛋白表達的影響 miR-310b mimics轉(zhuǎn)染組與NC轉(zhuǎn)染組相比，標志基因aP2和轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα蛋白的表達量均減少（P＜0.05），見圖 1、表 3。

Tab.2 TherelativeexpressionlevelsofPPARγ,C/EBPαand aP2 mRNA after transfection of miR-301b mimics表2 轉(zhuǎn)染miR-301b mimics后細胞中PPARγ、C/EBPα、aP2 mRNA相對表達量 （n=3，±s）

Tab.2 TherelativeexpressionlevelsofPPARγ,C/EBPαand aP2 mRNA after transfection of miR-301b mimics表2 轉(zhuǎn)染miR-301b mimics后細胞中PPARγ、C/EBPα、aP2 mRNA相對表達量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別NC轉(zhuǎn)染組miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組t PPARγ 1.000±0.130 0.405±0.144 5.304＊＊C/EBPα 1.000±0.151 0.163±0.083 8.414＊＊aP2 1.000±0.059 0.061±0.003 27.612＊＊

Fig.1 Effects of miR-301b on aP2,C/EBPα and PPARγ protein expression in ST2圖1 miR-301b對ST2中aP2、C/EBPα和PPARγ蛋白表達的影響

Tab.3 TherelativeexpressionlevelsofPPARγ,C/EBPαand aP2 protein after transfection of miR-301b mimics表3 轉(zhuǎn)染miR-301b mimics后細胞中PPARγ、C/EBPα、aP2蛋白相對表達量 （n=3，±s）

Tab.3 TherelativeexpressionlevelsofPPARγ,C/EBPαand aP2 protein after transfection of miR-301b mimics表3 轉(zhuǎn)染miR-301b mimics后細胞中PPARγ、C/EBPα、aP2蛋白相對表達量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別PPARγC/EBPαaP2 NC轉(zhuǎn)染組miR-301b mimics轉(zhuǎn)染組t 1.442±0.057 0.823±0.020 17.807＊＊1.576±0.032 0.595±0.076 20.524＊＊1.229±0.115 0.718±0.016 7.601＊＊

3 討論

MSCs在歷經(jīng)前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程中，受到若干特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如PPARγ及C/EBPα等［6］。此后在這些促進脂肪細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作用下，更多下游脂肪細胞靶基因開始表達，如aP2等。因此，檢測這些相應(yīng)基因的表達可更好地反映MSCs的成脂分化狀態(tài)。本研究探討了miR-301b與MSCs分化間的關(guān)系。結(jié)果顯示，與對照組比較，成脂分化誘導組miR-301b的表達量降低，提示miR-301b可能參與了脂肪細胞分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-310b mimics轉(zhuǎn)染組與NC 轉(zhuǎn)染組相比，細胞中 PPARγ、C/EBPα、aP2的mRNA和蛋白相對表達量均下降，表明提高ST2細胞內(nèi)miR-301b水平能夠阻斷細胞成脂特異性轉(zhuǎn)錄因子和基因的mRNA和蛋白的表達，抑制MSCs分化為成熟脂肪細胞，證實了miR-301b能抑制脂肪細胞的分化。

目前，就miR-301b的生理功能研究主要集中在其與腫瘤和免疫應(yīng)答之間的關(guān)系上。如miR-301b參與調(diào)控核受體亞家族C組成員2（nuclear receptor subfamily group c member 2，NR3C2）的表達，可削弱NR3C2的抑癌細胞轉(zhuǎn)移入侵作用，降低胰腺癌患者生存率［7］。Li等［8］研究顯示，miR-301b 能通過減少c-Myb轉(zhuǎn)錄，正調(diào)節(jié)抗炎細胞因子白細胞介素 4（interleukin 4，IL-4）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），負調(diào)節(jié)促炎細胞因子巨噬細胞炎癥蛋白（MIP-1α）和白細胞介素 17（interleukin 17，IL-17A）的生成，起到免疫活化作用。另有研究顯示，miR-301b可能通過直接作用于病毒RNA的方式阻礙豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的復制，這為利用miRNAs進行抗病毒治療提供了新思路［9］。然而，目前miR-301b對MSCs向脂肪細胞分化的影響研究較少，且miR-301b是通過何種機制來對脂肪細胞分化進行調(diào)控尚不明確。

Li等［10］研究表明，與 miR-301b 同家族的 miR-301a存在于3T3-L1細胞中，直接以PPARγ基因為靶點減少其表達量，可抑制細胞向脂肪細胞分化。Wang等［11］研究顯示，miR-301a和 miR-301b 可與N-myc下游調(diào)控基因 2（N-myc downstreamregulated gene 2，NDRG2）的 3′-UTR 結(jié)合并下調(diào)NDRG2的表達，從而提高前列腺癌細胞的抗輻射性。另外，NDRG2也被證實參與了MSCs的分化調(diào)節(jié)，下調(diào)NDRG2的表達能夠抑制MSCs成脂分化［12］。本研究中miR-301b下調(diào)了一些成脂特異性基因的表達水平，這種調(diào)控可能是直接的，如miR-301b可能以C/EBPα、aP2的基因為靶基因；也有可能是間接的，如miR-301b可能通過靶向減少NDRG2的表達，從而干擾了NDRG2的MSCs分化調(diào)節(jié)功能，最終抑制了脂肪細胞的分化形成。目前，因miRNAs與其作用基因之間存在一對多的關(guān)系，結(jié)合生物信息學預測技術(shù)尋找miR-301b的多個潛在靶基因并加以驗證，進一步發(fā)現(xiàn)其調(diào)控脂肪細胞分化的詳細信號網(wǎng)絡(luò)，還需更多實驗研究加以闡述。

綜上所述，尋找到影響某個生命過程的miRNAs，定位其靶基因并揭示其作用機制，對認識miRNAs這種生物小分子的功能有一定意義。越來越多的miRNA基因功能的揭示將使更完整地勾畫生物活性功能過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成為可能，從而加深對生命現(xiàn)象的理解。

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