張永平范紅偉張文獻(xiàn)顧海峰陳幼源**

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海奉賢201403；2.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海閔行201103；3.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海嘉定201800）

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科甜瓜屬中的1個(gè)栽培種，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，國內(nèi)外廣泛栽培。甜瓜在人工雜交制種過程中，因去雄不及時(shí)或不徹底，?；煊心副咀越幌捣N子，同時(shí)甜瓜品種較為繁雜，且品種之間的植物形態(tài)非常接近，品種間的種子很難鑒別。傳統(tǒng)的甜瓜種子鑒別方法是通過表型特征來判斷，該方法耗時(shí)耗力；通過同工酶和種子蛋白電泳技術(shù)進(jìn)行鑒別也受環(huán)境或甜瓜發(fā)育階段等影響，存在較大的缺點(diǎn)。而分子標(biāo)記技術(shù)檢測的是在基因組DNA水平上的差異，不受外界環(huán)境的影響，因此檢測結(jié)果非常穩(wěn)定[1]。在已建立的分子標(biāo)記技術(shù)中，ISSR（簡單序列重復(fù)區(qū)間）標(biāo)記是1種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的十分有效的分子標(biāo)記，具有模版需要量少、無需試劑盒、結(jié)果記錄方便、試驗(yàn)成本低、操作簡單、試驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)[2]。Zhao等[3]利用ISSR標(biāo)記構(gòu)建了24個(gè)桑樹品種的指紋圖譜。SRAP（序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）是1種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、可產(chǎn)生共顯性標(biāo)記及便于克隆測序目標(biāo)片段等特點(diǎn)，且擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性豐富[4]，已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建[5～6]。本研究采用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甜瓜雜交種紅優(yōu)及其親本的DNA指紋圖譜，同時(shí)進(jìn)行了與紅優(yōu)相同類型的5個(gè)厚皮甜瓜品種的分子鑒別，旨在為保護(hù)研究者知識(shí)產(chǎn)權(quán)和消費(fèi)者利益提供簡便快捷的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜瓜品種紅優(yōu)及其親本種子，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供；世農(nóng)M103、精選紅妃、雪紅蜜和雪里紅種子（與紅優(yōu)同為白皮紅肉類型的厚皮甜瓜品種），于種子市場購得。試驗(yàn)所用的提取DNA、PCR試劑和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司，其中SRAP和ISSR引物序列詳見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取及檢測

采用改良過的CTAB法提取基因組DNA[7]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

SRAP擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系，其中25 mmoL/L MgCl22.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmoL/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，0.1 μmoL/L引物各3.0 μL，10ng/μL模板DNA 3.0 μL，滅菌雙蒸水6.4 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存[8]。

表1 SRAP和ISSR引物序列

ISSR擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系，其中包含25 mmoL/L MgCl22 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmoL/L dNTP0.4 μL，5 U/μL Taq E 0.2 μL，10 ng/L模板DNA 3 μL，0.1 μmoL/L Primer 3 μL，滅菌雙蒸水9.4 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min后4℃保存[8]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠（含EB）電泳分離，電壓120 v，時(shí)間約1.5 h，Gel DocTMEQ 170-8060凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

用40對SRAP和40個(gè)ISSR引物對供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中40對SRAP引物和15個(gè)ISSR引物均能得到較為穩(wěn)定的擴(kuò)增圖譜，但大多數(shù)引物的擴(kuò)增結(jié)果在雙親及雜種之間是一致的，不能起到鑒別作用。最終篩選出1對SRAP特異引物（Me15-Em8）和2個(gè)ISSR引物（I-8和I-19）可將雜交種與其父母本分開；同時(shí)篩選出1個(gè)ISSR引物（I-19）可以將5個(gè)厚皮甜瓜品種一次性區(qū)分開，且重復(fù)性好。

2.2 擴(kuò)增結(jié)果分析

圖1 不同引物對各參試厚皮甜瓜材料的擴(kuò)增結(jié)果

表2 紅優(yōu)甜瓜及其父母本SRAP和ISSR擴(kuò)增特異譜帶

由圖1和表2可知，兩種標(biāo)記共3個(gè)（對）引物（Me15-Em8、I-8和I-19）能在材料間表現(xiàn)出多態(tài)。SRAP引物Me15-Em8在約250 bp和280 bp處擴(kuò)增出2條雙親的特異帶，在F1中2條特異帶也被擴(kuò)增出來，表現(xiàn)出雙親間互補(bǔ)特征帶；ISSR引物I-8在約500 bp和550 bp處擴(kuò)增出2條雙親的特異帶，在F1中2條特異帶也均存在；ISSR引物I-19在約480 bp和700 bp處擴(kuò)增出2條雙親的特異帶，在F1中兩條帶均存在，而在F1中又?jǐn)U增出1條約550 bp的特異帶區(qū)別于父母本。由此可見，3個(gè)（對）引物均能對供試材料的雙親和F1進(jìn)行有效鑒別。

通過ISSR引物I-19對5個(gè)相同類型的甜瓜品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2和表3。在引物I-19指紋圖譜中，紅優(yōu)比其他品種多1條約480 bp帶，即特異性標(biāo)記為I-19-480 bp；世農(nóng)M103比其他品種多1條約700 bp帶，即特異性標(biāo)記為I-19-700 bp；雪里紅比其他品種多1條約280 bp帶，即特異性標(biāo)記為I-19-280 bp；精選紅妃、紅優(yōu)和雪里紅比雪紅蜜和世農(nóng)M103兩個(gè)品種多1條約650 bp帶，而紅優(yōu)、雪里紅和世農(nóng)M103分別有特異標(biāo)記I-19-480 bp、I-19～280 bp和I-19-700 bp。因此，可用I-19-650 p、I-19-480 bp和I-19-280 bp鑒別精選紅妃，可用I-19-650 p和I-19-700 bp鑒別雪紅蜜。

圖2 ISSR引物I-19對5個(gè)甜瓜品種的擴(kuò)增結(jié)果

表3 引物I-19對5個(gè)甜瓜品種ISSR擴(kuò)增特異譜帶

3 討論

當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，品種混雜退化現(xiàn)象普遍，如假種混入種子市場，育種專家的權(quán)益和農(nóng)民的利益則會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害。目前許多園藝植物育種所使用的材料越來越集中于少數(shù)優(yōu)良品種或品系，使得選育出的新品種在更多的性狀上更加相似，難以區(qū)分?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展為建立快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的種子質(zhì)量鑒定體系提供了技術(shù)支撐，基因分子標(biāo)記的作物DNA指紋圖譜分析技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并取得了快速發(fā)展。在已建立的分子標(biāo)記技術(shù)中，ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)通常都是顯性或共顯性標(biāo)記[9]，所以父母本具有的特征帶在雜種F1代中通常也能表現(xiàn)出來。通過檢測F1代是否出現(xiàn)雙親的特異帶進(jìn)行雜種鑒定，目前已被廣泛應(yīng)用于多種作物的種子純度鑒定[10～12]。本試驗(yàn)成功篩選出1對SRAP引物和2個(gè)ISSR引物，可擴(kuò)增出紅優(yōu)甜瓜雙親的互補(bǔ)特征帶。因此，兩種標(biāo)記技術(shù)均適用于甜瓜的指紋圖譜構(gòu)建，都能有效鑒別甜瓜品種雙親及其雜種F1，可用于雜種純度鑒定。同時(shí)，在本研究中僅用1個(gè)ISSR引物即可鑒別出與紅優(yōu)相同類型的5個(gè)甜瓜品種，充分體現(xiàn)了ISSR技術(shù)的高效性，為紅優(yōu)甜瓜品種鑒別提供了有效、可靠的方法，在分子水平上為該品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)提供了技術(shù)保障。

[1]賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，29（4）：1～10.

[2]丁明忠，潘光堂，張中華，等.用ISSR分析四川苧麻品種（系）間的遺傳關(guān)系及雄性不育分子標(biāo)記的建立[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22（2）：183～187.

[3]Zhao W G，Miao X X，Zang B，et al.Construction of fingerprinting and genetic diversity of mulberry cultivars in China by ISSR markers[J].Acta Genetica Sinica，2006，33（9）：851～860.

[4]Li G，Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455～461.

[5]王剛，潘俊松，李效尊，等.黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構(gòu)建及側(cè)枝基因定位[J].中國科學(xué)C輯，2004，4（6）：510～516.

[6]張平湖，劉冠明.粵東地區(qū)果梅主栽品種的SRAP標(biāo)記多態(tài)性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（6）：27～29.

[7]張永平，朱為民，崔輝梅.上海地區(qū)番茄煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（4）：100～101.

[8]馬金駿.不結(jié)球白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的初步研究[D].2008：27.

[9]周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[10]劉沖，葛才林，任云英，等.SRAP、ISSR技術(shù)的優(yōu)化及在甘藍(lán)類植物種子鑒別中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22（4）：657～661.

[11]劉澤發(fā)，孫小武，董亞靜.SRAP標(biāo)記鑒定西瓜種子純度方法研究[J].中國瓜菜，2009（1）：5～8.

[12]胡漢嬌，邢姍姍，郭建夫，等.利用RAPD和ISSR引物對三系雜交水稻及其父母本的鑒定[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（3）：86～90.