楊繼業(yè)楊 帆，3崔冠慧孫勁沖程輝彩張麗萍*王雅娜劉洪偉

（1河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050081；2河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050081；3河北工業(yè)大學(xué)，天津300130）

自我國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，馬鈴薯栽培面積隨之增加，成為僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物。與此同時(shí)，馬鈴薯倒茬困難、連作障礙等問題日益嚴(yán)重（原霽虹，2015），使得土壤養(yǎng)分不足，有機(jī)質(zhì)含量下降，導(dǎo)致植株衰弱，土傳病害增加，如馬鈴薯早疫病病原菌茄鏈格孢菌（Alternaria solani），更易侵染衰弱植株的葉片、莖稈以及塊莖，危害嚴(yán)重，是馬鈴薯的主要病害之一（郭潤(rùn)婷 等，2016）。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯早疫病的防治主要通過化學(xué)防治，常用藥劑如丙森鋅、代森錳鋅、霜脲錳鋅等，化學(xué)農(nóng)藥雖然方便、快速，但長(zhǎng)期使用易造成生態(tài)環(huán)境污染嚴(yán)重，菌株抗藥性增加，同時(shí)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留危害人類健康，因此亟須尋找環(huán)境友好型生物防治的方法（Wharton et al.，2007；漆文選，2017）。王愛軍等（2013）篩選出2株萎縮芽孢桿菌，對(duì)馬鈴薯黑痣病、干腐病病原菌具有較強(qiáng)抑制作用。姚彥坡（2015）篩選出2株木霉菌株HNA14和HNA12，對(duì)馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病具有較好的防病效果。

目前芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯早疫病的防治研究較少，因芽孢抗逆性強(qiáng)，具有耐高溫、紫外線，易儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)以馬鈴薯早疫病病原菌茄鏈格孢菌作為指示菌，從河北省科學(xué)院生物研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存的生防菌株中篩選對(duì)馬鈴薯早疫病具有較強(qiáng)抑制效果的芽孢桿菌，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化及16S rDNA鑒定，同時(shí)對(duì)菌株代謝產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行研究，以期得到代謝產(chǎn)物抑菌活性穩(wěn)定的芽孢桿菌，為進(jìn)一步研制馬鈴薯早疫病新型生防制劑奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌為馬鈴薯早疫病病原菌茄鏈格孢菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院朱杰華教授提供。供試生防菌株為河北省科學(xué)院生物研究所微生物研究室保藏的600多株生防菌株。

供試培養(yǎng)基：PB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，配制方法參照細(xì)菌鑒定手冊(cè)（布坎南和吉本斯，1984；東秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2 拮抗菌篩選

1.2.1 拮抗菌初篩 取活化好的直徑為8 mm的茄鏈格孢菌菌餅，點(diǎn)種于PDA培養(yǎng)基（直徑90 mm）中央，26 ℃培養(yǎng)2 d，在菌塊四周點(diǎn)種生防菌株，培養(yǎng)4 d后觀察菌株抑菌效果。

1.2.2 拮抗菌復(fù)篩 將初篩所得拮抗菌經(jīng)二級(jí)搖床培養(yǎng)后，發(fā)酵液12 000 r·min-1離心10 min去除菌體，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾得到無(wú)菌濾液。吸取30 mL茄鏈格孢菌懸浮液（1×106cfu·mL-1）于300 mL融化的PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，打孔并點(diǎn)入100 μL上述無(wú)菌濾液，3～4 d后觀察抑菌效果。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)特征及生理生化特性 在PB平板上接種菌株，32 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌株菌落形態(tài)，復(fù)紅染色后于顯微鏡鏡檢。菌株生理生化特性參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（布坎南和吉本斯，1984）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）進(jìn)行鑒定。

1.3.2 基因組提取及16S rDNA序列擴(kuò)增與分析 采用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，選用16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR 反 應(yīng) 體系為50 μL：DNA模板2.5 μL，上下游引物各2 μL，2×Mix 25 μL，ddH2O 18.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并于生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 代謝產(chǎn)物的抑菌活性

1.4.1 熱穩(wěn)定性 將菌株BAF-6的發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌過濾器進(jìn)行除菌，得到發(fā)酵濾液，分別在60、70、80、90、100、121 ℃下熱處理 30 min，冷卻至室溫后，采用打孔法在含有茄鏈格孢菌的平板上打孔，并于孔中分別點(diǎn)入100 μL各處理的發(fā)酵濾液，3～4 d后測(cè)量各處理抑菌圈的大小，以未經(jīng)熱處理的發(fā)酵濾液為對(duì)照，以對(duì)照抑菌圈大小為活性100%，計(jì)算各處理的相對(duì)抑菌活性（楊艷紅 等，2017），每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4.2 蛋白酶穩(wěn)定性 分別用質(zhì)量濃度50 mg·L-1胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37 ℃處理菌株BAF-6發(fā)酵濾液2 h（胡忠亮 等，2017），以未經(jīng)蛋白酶處理的發(fā)酵濾液為對(duì)照，采用1.4.1中的方法測(cè)定并計(jì)算各處理的相對(duì)抑菌活性，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4.3 紫外穩(wěn)定性 將菌株BAF-6的發(fā)酵濾液放置在紫外燈下（20 W）20 cm處，分別照射2、4、6、8 h，以未經(jīng)紫外燈照射的發(fā)酵濾液為對(duì)照，采用1.4.1中的方法測(cè)定并計(jì)算各處理的相對(duì)抑菌活性，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4.4 酸堿穩(wěn)定性 用1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液分別將菌株BAF-6的發(fā)酵濾液pH值調(diào)節(jié)為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，靜置12 h后，調(diào)節(jié)pH至中性，以未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液為對(duì)照，采用1.4.1中的方法測(cè)定并計(jì)算各處理的相對(duì)抑菌活性，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 5.0軟件對(duì)所篩菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，并用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性分析及柱形圖的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

通過平板對(duì)峙法篩選出對(duì)茄鏈格孢菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株11株，通過測(cè)定菌株無(wú)菌濾液的抑菌活性，菌株BAF-6抑菌圈直徑較大，為2.4 cm（圖1、2），說明菌株及菌株發(fā)酵濾液均對(duì)病原菌抑制作用較強(qiáng)。

圖1 拮抗菌初篩

圖2 拮抗菌復(fù)篩

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株BAF-6的形態(tài)特征 菌株BAF-6菌落呈白色，不透明，近圓形，邊緣不規(guī)則，菌體桿狀，菌體長(zhǎng)約1.8 μm，寬約0.6 μm（圖3），產(chǎn)生橢圓形芽孢，芽孢中生。

2.2.2 菌株BAF-6的生理生化特性 通過2.2.1中菌株形態(tài)觀察及生理生化特性鑒定（表1），初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

2.2.3 菌株BAF-6的分子鑒定 將菌株BAF-6的16S rDNA序列和NCBI網(wǎng)站中與其基因序列同源性較高的菌株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果以及16S rDNA分子鑒定結(jié)果，將菌株BAF-6鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.3 菌株BAF-6的代謝產(chǎn)物性質(zhì)

2.3.1 熱穩(wěn)定性 從圖5可以看出，60～80 ℃熱處理菌株BAF-6的發(fā)酵濾液后，濾液對(duì)茄鏈格孢菌的相對(duì)抑菌活性均與對(duì)照無(wú)顯著差異，抑菌活性均在95%以上。90～121 ℃處理下，發(fā)酵濾液的相對(duì)抑菌活性顯著降低，但100 ℃處理下發(fā)酵液的相對(duì)抑菌活性仍在85%以上，121℃下的相對(duì)抑菌活性在50%以上，說明菌株發(fā)酵濾液具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖3 菌株BAF-6菌體形態(tài)

表1 菌株BAF-6的生理生化鑒定結(jié)果

圖4 菌株BAF-6的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.2 蛋白酶穩(wěn)定性 從圖6可以看出，采用蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶處理菌株BAF-6發(fā)酵濾液后，濾液對(duì)茄鏈格孢菌的相對(duì)抑菌活性均顯著降低，但仍在50%以上，說明菌株具有抑菌活性的物質(zhì)可能不是蛋白質(zhì)，也可能是蛋白質(zhì)但不包含芳香族、脂族氨基酸的羧基肽鍵，不含賴氨酸、精氨酸及疏水殘基肽鍵。

圖5 菌株BAF-6發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性

圖6 菌株BAF-6發(fā)酵時(shí)濾間液的蛋白酶穩(wěn)定性

圖7 菌株BAF-6發(fā)酵濾液的紫外穩(wěn)定性

2.3.3 紫外穩(wěn)定性 從圖7可以看出，經(jīng)紫外線照射后，菌株BAF-6發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的相對(duì)抑菌活性均無(wú)顯著變化。說明菌株發(fā)酵濾液抑菌活性不因紫外照射而降低，適合于田間應(yīng)用。

2.3.4 酸堿穩(wěn)定性 從圖8可以看出，菌株BAF-6發(fā)酵濾液在pH值為2～9時(shí)的相對(duì)抑菌活性與對(duì)照均無(wú)顯著差異，當(dāng)pH值為10時(shí)，菌株的相對(duì)抑菌活性仍為80%以上，說明菌株發(fā)酵濾液具有較高的酸堿穩(wěn)定性。

圖8 菌株BAF-6發(fā)酵濾液的酸堿穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

利用對(duì)病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌等有益微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治是防治農(nóng)作物病害的有效方法與技術(shù)（邱德文，2010），既響應(yīng)農(nóng)藥減施及化肥零增長(zhǎng)的政策，同時(shí)有益于環(huán)境、生態(tài)和人類健康。尋找高效生防菌資源，是生物防治途徑中最重要的環(huán)節(jié)。

目前防治馬鈴薯早疫病的生物菌劑主要為放線菌、木霉菌，芽孢桿菌的應(yīng)用很少。芽孢桿菌可產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，生存能力強(qiáng)，同時(shí)是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系優(yōu)勢(shì)種群，有利于在環(huán)境中存活、定殖和繁殖，因此具備較好的生防特性及開發(fā)前景（齊愛勇 等，2011）。本試驗(yàn)以馬鈴薯早疫病病原菌茄鏈格孢菌為指示菌，通過平板對(duì)峙法篩選到1株對(duì)其具有較強(qiáng)抑制效果的菌株BAF-6，經(jīng)鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

解淀粉芽孢桿菌是植物病害防治中一大類芽孢桿菌類群，在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生肽類、聚酮類、脂肽類等具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物（Chen et al.，2009）。薛鵬琦等（2011）從解淀粉芽孢桿菌YBWC43菌株中提取出可抑制油菜菌核病菌的桿菌霉素D和芬枯草菌素。本試驗(yàn)對(duì)BAF-6菌株發(fā)酵濾液性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明菌株BAF-6發(fā)酵濾液具有較高的熱穩(wěn)定性，且經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，發(fā)酵濾液的相對(duì)抑菌活性仍在50%以上，說明抑菌活性物質(zhì)可能有一部分并不是蛋白質(zhì)，需要進(jìn)一步對(duì)有效抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化；菌株BAF-6發(fā)酵濾液對(duì)紫外線照射具有較強(qiáng)的抗性，在后期菌株田間應(yīng)用過程中，發(fā)酵濾液中的活性物質(zhì)可以有效保留；發(fā)酵濾液在pH值2～10時(shí)，相對(duì)抑菌活性仍在80%以上，說明菌株發(fā)酵濾液具有較高的酸堿穩(wěn)定性?？梢娋闎AF-6具有開發(fā)成馬鈴薯早疫病新型生防制劑的潛力。

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