毛振方，林奇辰，王彬宇，張翠真，陳志和，簡少卿，趙大顯*

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；2.江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點實驗室，江西 南昌 330031)

中華絨螯蟹作為我國重要的經(jīng)濟甲殼動物，隨著其規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展,養(yǎng)殖用水污染也在不斷地加劇，其中除了受工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活污水影響外，生產(chǎn)中大量使用硫酸銅等進行病害防治和清塘滅藻已成為重要的水污染原因之一。研究表明，養(yǎng)殖水環(huán)境Cu2+濃度超標會引起甲殼動物免疫力的下降，繼而提高病原易感性，導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中疾病的爆發(fā)[1-3]。因此，有關(guān)養(yǎng)殖水體中的Cu2+濃度對中華絨螯蟹毒性作用及其對免疫系統(tǒng)影響的研究倍受關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者已從生理生化水平分析了Cu2+濃度對中華絨螯蟹血淋巴免疫指標的影響[4-6]，而有關(guān)Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因表達的影響還鮮有報道。本研究以重金屬Cu2+為應(yīng)激源，測定和分析了其對中華絨螯蟹的毒性作用及對免疫相關(guān)基因表達的影響，旨在闡明重金屬Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)影響的分子機理，并為利用甲殼動物的免疫相關(guān)基因表達預(yù)測環(huán)境早期污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所用中華絨螯蟹(100 g)購于江西省南昌市水產(chǎn)批發(fā)市場，于實驗室采用經(jīng)充分曝氣的自來水暫養(yǎng)7 d，水溫為23 ℃，pH為6.35，后選取健康、活潑且四肢健全的蟹進行重金屬銅離子(Cu2+)脅迫實驗，期間日換水1/2～1/3，及時清除污物，并于脅迫后0、12、24、36、48、60、72 h隨機取蟹抽提血淋巴，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min收集血細胞作為實驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 重金屬Cu2+梯度設(shè)置 重金屬銅離子種類和來源為：Cu2+(Cu2SO4·5H2O)。按《中華人民共和國漁業(yè)水質(zhì)標準 GB11607-89》Cu2+的質(zhì)量濃度(Cu2+≤0.01 mg/L)的10倍、50倍、100倍設(shè)置實驗濃度梯度，即Cu2+的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為：0.10，0.50，1.00 mg/L。各濃度均設(shè)置3個重復(fù)，并以不加Cu2+組為對照組。

實驗在50 cm×40 cm×30 cm的塑料水箱內(nèi)進行，各質(zhì)量濃度梯度分別放健康中華絨螯蟹10只，試驗期間的養(yǎng)殖管理與暫養(yǎng)期間完全相同，換水時分別加入相對應(yīng)Cu2+濃度的養(yǎng)殖用水。試驗開始后于0、12、24、36、48、60、72 h取樣，用預(yù)先加入滅菌預(yù)冷抗凝劑(NaCl 510 mmol/L；C6H12O6100 mmol/L；C6H8O7200 mmol/L；C6H5Na3O730 mmol/L；EDTA-2Na 10 mmol/L；pH 7.3)的消毒5號針頭和5 mL注射器從中華絨螯蟹第三步足基部血竇處抽取血淋巴，并將收集好的血淋巴于4 ℃ 12 000 r/min離心 20 min，棄上清，所得沉淀即為血細胞。血細胞樣品均保存于-70 ℃下冰箱待測。

1.2.2 總RNA的提取 于血細胞沉淀中按0.1 g/mL加入Unizol Reagent，振蕩混勻，加入等體積的氯仿，蓋緊蓋子，顛倒搖動15 s，室溫放置2～3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，移至新的EP管中；向EP管中加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃、12 000 rmp離心10 min；棄上清，加入等體積75%乙醇洗滌，7 500 r/min離心5 min，溶于一定體積的DEPC水中。用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，根據(jù)其濃度，取約150 ng進行凝膠電泳分析，觀察是否被降解。

1.2.3 cDNA模板的準備 以總RNA為模板，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)方法步驟(for SYBR?Green qPCR)進行cDNA合成。主要包括以下步驟：

第一步：總RNA樣品去基因組DNA污染反應(yīng)。反應(yīng)體系：5 × gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1μg，RNase Free dH2O 補足到10 μL；反應(yīng)程序：將上述10 μL體系于42 ℃反應(yīng)2 min，保存于4 ℃；

第二步：逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)。反應(yīng)體系：第一步反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，5× PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，反應(yīng)體系總體積為20 μL；反應(yīng)程序：將上述20 μL體系于37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計，其中包括內(nèi)參基因(β-actin)和免疫相關(guān)基因(LGBP、PPAF、GPx、GST、Integrin、PXN、Tube、Dorsal)引物各1對，具體序列詳見表1；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

實時熒光定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX Connect real-time PCR detection system儀器上進行。20 μL PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán)；95 ℃ 30 s、58～60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 1 min，1 cycle。每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用CFX ManagerTM軟件進行分析，將CT值作為樣本表達量標準，使用Livak法[7]，即2-△△CT法，來計算脅迫組相對于對照組的基因表達水平。其中，△△CT=(待測組目的基因平均CT值-待測組內(nèi)參基因平均CT值)-(對照組目的基因平均CT值-對照組內(nèi)參基因平均CT值)。利用SPSS軟件進行方差分析，Excel軟件制成柱形直觀圖。

表1 實時熒光定量PCR反應(yīng)引物

2 結(jié)果與分析

2.1 水體Cu2+脅迫濃度對中華絨螯蟹的毒性作用

不同質(zhì)量濃度Cu2+對中華絨螯蟹進行脅迫發(fā)現(xiàn)，對照組和10倍濃度組(Cu2+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L)中，中華絨螯蟹在試驗期間(72 h)無明顯死亡現(xiàn)象，且活力正常；50倍和100倍濃度組(Cu2+質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/L和1.0 mg/L)中，中華絨螯蟹死亡現(xiàn)象比較明顯，表現(xiàn)為：脅迫12 h時，50倍濃度組中，中華絨螯蟹死亡率達25%，而100倍濃度組中，中華絨螯蟹死亡率達50%；脅迫24 h時，50倍濃度組中，中華絨螯蟹死亡率達75%，而100倍濃度組中華絨螯蟹死亡率達100%；脅迫36 h后，50倍濃度組中，中華絨螯蟹死亡率達100%。結(jié)果表明，在Cu2+脅迫中華絨螯蟹72 h后，低濃度組(10倍濃度組和對照組)中，中華絨螯蟹無明顯死亡現(xiàn)象，而高濃度組(50倍和100倍濃度組)中，中華絨螯蟹均全部死亡(圖1)，說明高濃度Cu2+脅迫對中華絨螯蟹具有明顯的毒性作用。鑒于以上結(jié)果，本試驗選用10倍濃度組(Cu2+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L)和對照組(Cu2+質(zhì)量濃度為0 mg/L)來探討Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因表達的影響。

2.2 水體Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因表達的影響

2.2.1 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹模式識別相關(guān)基因LGBP mRNA表達的影響 對0.1 mg/L Cu2+脅迫中華絨螯蟹不同時間組別進行qRT-PCR和電泳檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因(β-actin)與LGBP基因在各組別中均被檢測到特異性擴增，且擴增效率均基本一致。進一步對不同組別LGBP表達量分析發(fā)現(xiàn)，在脅迫36 h組，中華絨螯蟹LGBP表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而后表現(xiàn)為降低趨勢，在脅迫60 h組中，LGBP表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)。

圖1 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹的毒性作用Fig.1 Toxic effects of Cu2+ stress on Eriocheir sinensis

圖2 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹LGBP基因mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Cu2+ stress on the expression of LGBP mRNA in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖3 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹Tube基因mRNA表達的影響Fig.3 Effect of Cu2+ stress on the expression of Tube mRNA in Chinese mitten mrab Eriocheir sinensis

圖4 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹Dorsal基因mRNA表達的影響Fig.4 Effect of Cu2+ stress on the expression of Dorsal mRNA in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

2.2.2 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)基因表達的影響 對0.1 mg/L Cu2+脅迫中華絨螯蟹不同時間組別進行qRT-PCR和電泳檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因(β-actin)與免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)基因Tube和Dorsal在各組別中均被檢測到特異性擴增，且擴增效率均基本一致。進一步對不同組別Tube和Dorsal表達量分析發(fā)現(xiàn)，在脅迫48 h組，中華絨螯蟹Tube表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而后表現(xiàn)為降低趨勢，在脅迫72 h組中，Tube表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖3)；在脅迫48 h組，中華絨螯蟹Dorsal 表達量顯著高于對照組(P<0.05)，在脅迫60 h組中，Dorsal表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖4)。

2.2.3 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫效應(yīng)相關(guān)基因表達的影響 對0.1 mg/L Cu2+脅迫中華絨螯蟹不同時間組別進行qRT-PCR和電泳檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因(β-actin)與免疫效應(yīng)相關(guān)基因PPAF、GPx、GST和PXN在各組別中均被檢測到特異性擴增，且擴增效率均基本一致。進一步對不同組別PPAF、GPx、GST和PXN表達量分析發(fā)現(xiàn)，在脅迫12 h、48 h組，中華絨螯蟹PPAF表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而后在脅迫60 h、72 h組中，PPAF表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖5)；在脅迫36 h組，GPx表達量顯著高于對照組(P< 0.05)，而后在脅迫72 h組中，GPx表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖6)；GST表達量逐步下降，在24 h組中顯著低于對照組(P<0.05)，而后在脅迫36 h、48 h組中，GST表達量顯著高于對照組(P<0.05)，隨后在72 h組又表現(xiàn)為顯著低于對照組(P< 0.05)(圖7)；在脅迫12 h組，PXN表達量顯著高于對照組(P<0.05)，而后呈下降趨勢，至72 h組中，PXN表達量顯著低于對照組(P<0.05)(圖8)。

圖5 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹PPAF基因mRNA表達的影響Fig.5 Effect of Cu2+ stress on the expression of PPAF mRNA in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖6 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹GPx基因mRNA表達的影響Fig.6 Effect of Cu2+ stress on the expression of GPx mRNA in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖7 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹GST基因mRNA表達的影響Fig.7 Effect of Cu2+ stress on the expression of GST mRNA in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖8 Cu2+脅迫對中華絨螯蟹PXN基因mRNA表達的影響Fig.8 Effect of Cu2+ stress on the expression of PXN mRNA in Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高濃度Cu2+對中華絨螯蟹具有明顯的毒性作用。銅作為甲殼動物重要的營養(yǎng)素，也是合成血藍蛋白的必需成分之一，對多種生長發(fā)育相關(guān)的生物酶如細胞色素氧化酶、碳酸酐酶多的組成和功能有重要的意義[3-8]。然而，過量的Cu2+會對生物機體產(chǎn)生毒害作用，這種危害可以反映在生物大分子(如 DNA、RNA、各種酶)、細胞、器官、個體、種群和生態(tài)系統(tǒng)等各個水平上[9]。楊志彪[4]發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+濃度的增高，中華絨螯蟹鰓、肝胰腺、XO-SG和YO等組織器官的結(jié)構(gòu)和功能受到了不可逆的損害，XO-SG分泌MIH和YO分泌20-HE的場所受到破壞，20-HE的分泌受到了抑制，導(dǎo)致蛻皮率下降，從而影響中華絨鰲蟹的生長。本試驗發(fā)現(xiàn)，在試驗濃度條件下，中華絨螯蟹的死亡率隨著Cu2+濃度的升高而增加。

本研究結(jié)果還表明，水體Cu2+脅迫顯著影響中華絨螯蟹免疫識別、信號傳導(dǎo)和效應(yīng)反應(yīng)相關(guān)基因的表達。甲殼動物棲息于水底，受環(huán)境中重金屬污染的機會較大[10]，Cu2+是甲殼動物體內(nèi)最容易被檢測到的重金屬之一[11]，因此，有關(guān)養(yǎng)殖水體中的Cu2+濃度及其對甲殼動物免疫和生理生化反應(yīng)影響的研究已倍受關(guān)注[12]。已有研究表明，水體Cu2+脅迫對甲殼動物細胞和體液免疫功能具有顯著影響[5]。LGBP作為一種模式識別蛋白，在甲殼動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[13-15]。它通過識別革蘭氏陰性菌的細胞壁成分脂多糖和真菌的細胞壁成分β-1,3-葡聚糖促進血淋巴細胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等細胞免疫反應(yīng)和激活蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，引起抗菌肽的合成等體液免疫反應(yīng)[13]；Dorsal基因作為核轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要一員，能夠通過信號通路所具有的信號級聯(lián)反應(yīng)，將免疫信號傳遞到細胞核內(nèi)，調(diào)控抗菌肽等免疫相關(guān)基因的表達和分泌，從而在抗真菌和細菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用[16]；Tube基因作為Toll信號通路中的重要組分，在機體存活、發(fā)育以及先天性免疫等生理活動中具有重要的作用[17]。Yu等[17]發(fā)現(xiàn)，Tube在中華絨螯蟹免疫和發(fā)育方面具有重要的作用，具有免疫和發(fā)育的雙重功能。PPAF、GPx、GST和PXN作為免疫效應(yīng)基因，在中華絨螯蟹先天免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用[18-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫模式識別蛋白相關(guān)基因(LGBP)、免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)基因(Dorsal、Tube)及免疫效應(yīng)相關(guān)基因(PPAF、GPx、GST、PXN)的表達均有顯著影響，從分子水平說明水體Cu2+脅迫對中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)的具有影響。綜上所述，重金屬Cu2+脅迫對中華絨螯蟹具有明顯的毒性作用，且顯著影響其免疫相關(guān)基因的表達。

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