王新博，任永哲，岳慧芳，李 樂，呂偉增，史校艷，辛澤毓，王志強(qiáng)，林同保

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002；3.省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物。干旱是影響小麥生長和限制產(chǎn)量的非生物因素之一，在小麥的生長發(fā)育期內(nèi)，經(jīng)常會遇到干旱脅迫。干旱對小麥產(chǎn)生的影響以及小麥對干旱脅迫的響應(yīng)方面，前人已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[1-4]。干旱脅迫不僅影響小麥幼苗、根系等組織器官的生長，還影響其非結(jié)構(gòu)碳水化合物的代謝以及小麥分蘗、小穗數(shù)和穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀，進(jìn)而影響小麥產(chǎn)量。此外，從個體、細(xì)胞等不同層面上也研究了小麥干旱脅迫下的生理生態(tài)變化及其響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制[5-7]。干旱脅迫下，通過誘導(dǎo)干旱響應(yīng)基因差異表達(dá)，可以使小麥對干旱脅迫做出響應(yīng)。

植物對干旱脅迫的響應(yīng)非常復(fù)雜，不僅包括生理生化水平的調(diào)節(jié)，還包括分子水平的調(diào)控。前人雖然已經(jīng)做了大量研究，但小麥干旱響應(yīng)的機(jī)制仍尚未完全解析。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)水肥資源高效利用課題組前期利用iTRAQ技術(shù)鑒定到一個干旱響應(yīng)蛋白TaEF-1α (Elongation factor 1 alpha ，EF-1α)。有研究表明，EF-1α有 3 個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 GTP 結(jié)合，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ與tRNA結(jié)合，主要參與蛋白的翻譯過程[8]。EF-1α還可能具有其他重要的功能。研究表明，EF-1α具有類似分子伴侶的活性，能夠和未正確折疊的蛋白相互作用并加速這些蛋白的降解[8]。此外，EF-1α還參與了信號傳導(dǎo)、翻譯控制、凋亡、細(xì)胞骨架組成、病毒復(fù)制及癌基因轉(zhuǎn)化等許多重要的細(xì)胞過程[9-14]。但目前關(guān)于該基因參與植物抗旱性方面的研究尚未見報(bào)道。本研究利用VIGS技術(shù)將該基因進(jìn)行沉默，對其功能進(jìn)行了研究，以期為改良小麥抗旱性提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料和方法

1.1 材料與培養(yǎng)方法

本試驗(yàn)所用材料為鄭麥9023。選取大小均勻的小麥種子用1%H2O2消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗3～4次。消毒后，在培養(yǎng)皿中浸泡24 h后，將種子擺放于營養(yǎng)土中，用盆栽方式進(jìn)行種植。將盆栽置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。溫度為(20±2)℃，光周期為16/8 h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度為200 lux。在二-三葉期進(jìn)行VIGS侵染接種[15]。設(shè)置正常灌水和干旱2個處理(干旱處理接種后不再灌水)，即：NS(未進(jìn)行干旱處理植株)、DS(干旱處理植株)、BSMV0( VIGS侵染陰性對照)；TaEF-1α基因侵染的不同植株(BSMVTaEF-1α-1、BSMVTaEF-1α-2、BSMVTaEF-1α-3和BSMVTaEF-1α-4)。接種后培養(yǎng)20 d后取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA提取

利用TRIzol試劑提取葉片總RNA。用兩步反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time；TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄混合物配好后按如下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：42 ℃，2 min；37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄完成后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Real-time PCR

用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于定量PCR的TaEF-1α基因特異引物以及TaActin和TaGAPDH2個內(nèi)參基因的引物。TaEF-1α特異性引物為：TaEF-1α-F：5′-CACACCTCGCACATTG-3′；TaEF-1α-R：5′-ATGCCAGCATCACCATTCT-3′。內(nèi)參基因TaGAPDH特異性引物：TaGAPDH-F：5′-TGTCTGTGGTGTCAATGA

GAAGGA-3′；TaGAPDH-R：5′-GCAAGAGGAGCAAGG

CAGTTAGT-3′。內(nèi)參基因TaActin特異性引物：TaActin-F：5′-ACCTTCAGTTGCCCAGCAAT-3′；TaActin-R：5′-CAGAGTCGAGCACAATACCAGTTG-3′。

使用Bio-Rad IQ5實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。每個反應(yīng)包括25 μL 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物，0.4 μL引物(正向和反向)，12.5 μL SYBR Premix ExTaq(2×)，100 ng cDNA模板并添加無核酸酶的水，共25 μL反應(yīng)體系。將反應(yīng)物在95 ℃進(jìn)行模板變性30 s；然后進(jìn)行95 ℃，5 s和60 ℃，30 s，40個循環(huán)。每個樣品4次重復(fù)。

1.4 VIGS載體構(gòu)建

VIGS試驗(yàn)中涉及的載體有α、β、γ和γ-PDS-as共4種，載體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳鋒教授課題組提供?？寺aEF-1α的基因特異序列，用T4DNA連接酶與γ載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR篩選和雙酶切驗(yàn)證確定陽性克隆，將正確的質(zhì)粒載體命名為BSMVTaEF-1α。對載體進(jìn)行線性化，用RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7(Promega，Madison)把線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。取0.5 μL體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DEPC處理水稀釋10倍，電泳檢測。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 VIGS侵染過程

體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物α、β、γ(或重組的γ)等體積混合，用DEPC處理水稀釋，加入FES緩沖液[16]。在二-三葉期接種[15]，接種后第10天，在第3片葉片上出現(xiàn)斑點(diǎn)條紋的感染表型。感染后的干旱處理不再灌水。接種后第20天，收集第3和第4葉，-80 ℃保存。一部分用于測量生理指標(biāo)，另一部分用于提取總RNA，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。試驗(yàn)同時設(shè)正常灌水未接種的空白對照(NS)、干旱脅迫未接種的空白對照(DS)、干旱處理接種γ空載體的陰性對照(BSMV0)、干旱處理接種γ-PDS-as載體的陽性對照(BSMVPDS)和干旱處理接種重組后γ載體(BSMVTaEF-1α)的試驗(yàn)組。接種γ-PDS-as載體的陽性對照侵染成功后會出現(xiàn)葉片漂白失綠現(xiàn)象。

1.6 VIGS相關(guān)生理指標(biāo)的測定

1.6.1 葉片相對含水量的測定 葉片相對含水量(RWC)采用Flexas的方法[17]。取新鮮小麥葉片稱取質(zhì)量(FW)，然后在蒸餾水中浸泡6 h。取出葉片用吸水紙吸干葉片表面的水分，然后稱取質(zhì)量，隨后再將葉片放入蒸餾水浸泡6 h，取出擦干葉片表面水分，稱取質(zhì)量，反復(fù)數(shù)次，直至葉片的質(zhì)量不再增加為止。此時稱取的質(zhì)量即為葉片吸水飽和時的質(zhì)量(TW)，然后將葉片樣品置于烘箱烘干，并稱取葉片的質(zhì)量(DW)。葉片相對含水量RWC (%) = ((FW -DW) /(TW -DW)) × 100。

1.6.2 葉片相對電導(dǎo)率的測定 葉片相對電導(dǎo)率的測定參照Yan等[18]的方法。新鮮的葉片被切成10 cm的片段用去離子水洗滌3次。放在含有10 mL去離子水的旋蓋離心管中在室溫下放置24 h。24 h后，用電導(dǎo)儀記錄電導(dǎo)率(C1)。然后，將離心管置于100 ℃沸水浴20 min。溶液冷卻至室溫，再次記錄電導(dǎo)率(C2)。以去離子水為對照，計(jì)算公式：相對電導(dǎo)率=(C1/C2)×100%。

1.6.3 丙二醛(MDA)含量的測定 丙二醛含量的測定采用陳建勛等[19]的方法。取0.5 g葉片，液氮速凍，于組織研磨器充分研磨，加入5 mL 0.05 mmol/L預(yù)冷的PBS(pH值7.8)搖勻，于4 °C下10 000 r/min離心20 min，上清液(酶液)轉(zhuǎn)入離心管中，置于0～4 °C保存。取0.5 mL酶液(對照用0.5 mL 0.05 mmol/L pH值7.8 PBS代替酶液)(做3個重復(fù))+3mL TBA-振蕩-沸水浴上反應(yīng)30 min-冷卻至室溫(至少30 min)-比色(OD600、OD532、OD450)。計(jì)算MDA含量：MDA濃度(mmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450；MDA含量(μmol/g)=C×V/W。

式中V為提取液體積(5 mL)，W為樣品鮮質(zhì)量(0.5 g)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel 2007進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaEF-1α基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量

前期研究表明，干旱脅迫下，TaEF-1α在蛋白水平上的表達(dá)量上調(diào)了52.8%。本研究中又對其在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，與正常灌水相比，干旱脅迫下，以TaGAPDH作為內(nèi)參基因時，基因TaEF-1α的表達(dá)量升高了67.2%(圖1-Ⅰ)；以TaActin作為內(nèi)參基因時，基因TaEF-1α的表達(dá)量升高了47.3%(圖1-Ⅱ)。說明干旱脅迫后，該基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量變化與蛋白水平上的變化趨勢一致，均表現(xiàn)為受干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(圖1)。

Ⅰ.內(nèi)參基因(TaGAPDH)；Ⅱ.內(nèi)參基因(TaActin)；CK.正常水分處理；Dr.干旱處理。生理指標(biāo)，每個值表示為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±SE；RNA表達(dá)量，每個數(shù)值表示4次技術(shù)重復(fù)的平均值±SE。 根據(jù)Duncan的多重范圍測試，不同的大寫字母表示在P<0.01時顯著不同。圖2, 4-6同。

Ⅰ.Reference gene(TaGAPDH);Ⅱ.Reference gene(TaActin);CK.No water stress;Dr.Drought stress.Physiological indicators, each value is expressed as mean±SE of three independent experiments；RNA expression amounts, and each value represents mean±SE of four technical replicates. Means followed by different big letters are significantly different atP< 0.01 according to Duncan′s multiple range test. The same as Fig.2,4-6.

圖1正常灌水處理和干旱處理小麥葉片TaEF-1α基因的相對表達(dá)量
Fig.1RelativeexpressionofTaEF-1αgeneinnormalirrigatedanddrought-treatedwheatleaves

2.2 VIGS侵染植株干旱脅迫下基因TaEF-1α的mRNA表達(dá)量

對VIGS侵染后的植株及各處理對照植株中TaEF-1α基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，相比于正常灌水(NS)，干旱處理(DS)的mRNA的表達(dá)水平和BSMV0植株的mRNA的表達(dá)水平都極顯著升高。但與干旱處理(DS)相比，侵染BSMVTaEF-1α載體的植株中，不同株系mRNA的表達(dá)水平均極顯著下調(diào)。說明干旱脅迫能誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá)，而VIGS技術(shù)沉默該基因后，又降低了其表達(dá)量，在干旱脅迫下仍然處于較低的表達(dá)水平(圖2)。

2.3 VIGS侵染TaEF-1α基因后的表型

VIGS接種后，開始進(jìn)行干旱處理(干旱處理不再灌水)。接種后第10天，侵染γ-PDS-as載體成功的陽性對照植株開始出現(xiàn)花斑條紋(接種第10天表型)(圖3-A、B)，繼續(xù)培養(yǎng)，直到接種后第20天，干旱條件下，接種BSMVTaEF-1α載體的植株開始出現(xiàn)葉片下垂的表型 (圖3-C)，而侵染空載體的陰性對照植株未出現(xiàn)此葉片失水表型 (圖3-D)。

NS.未進(jìn)行干旱處理植株；DS.干旱處理植株；BSMV0. VIGS侵染陰性對照；BSMVTaEF-α-1、BSMVTaEF-α-2、BSMVTaEF-α-3和BSMVTaEF-α-4. VIGS侵染的不同植株。圖3-6同。

NS. Non stressed plants；DS.Drought-stressed plants；BSMV0.Negative control of VIGS system；BSMVTaEF-1α.TaEF-1αknock-down-plants. The same as Fig.3-6.

圖2不同處理TaEF-1α基因mRNA的相對表達(dá)量
Fig.2TherelativeexpressionlevelofTaEF-1αgeneindifferentlytreatedwheatplants

圖3 VIGS侵染后的表型和干旱處理接種20 d的抗旱性表型鑒定Fig.3 The phenotype of the virus-infected wheat plants and the identification of drought tolerance

2.4 VIGS干旱脅迫下小麥葉片生理指標(biāo)的變化

相對于正常灌水下的植株(NS)，干旱處理下植株(DS)的葉片相對含水量只下降了10.0%，侵染的陰性對照植株(BSMV0)葉片的相對含水量下降了10.1%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的植株的葉片含水量下降了65.8%；相比于干旱處理未侵染植株(DS)的葉片相對含水量，侵染陰性對照植株(BSMV0)葉片的相對含水量沒有顯著變化，而侵染BSMVTaEF-1α基因的植株的葉片相對含水量下降了60.0%(圖4)。

干旱脅迫下，相比于正常灌水未侵染的小麥(NS)的葉片相對電導(dǎo)率，未侵染的小麥(DS)和侵染的陰性對照植株(BSMV0)小麥葉片的相對電導(dǎo)率分別升高了319.7%和325.0%，侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的葉片相對電導(dǎo)率升高了686.1%；相比于未侵染的小麥(DS)的葉片相對電導(dǎo)率，侵染的陰性對照植株(BSMV0)葉片的相對電導(dǎo)率沒有顯著差異，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的葉片相對電導(dǎo)率升高了87.3%(圖5)。

干旱脅迫下，相比于正常灌水未侵染的小麥(NS)葉片的丙二醛含量，未侵染的小麥(DS)的葉片丙二醛含量升高了59.4%，侵染的陰性對照小麥(BSMV0)葉片的丙二醛含量升高了64.7%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的葉片丙二醛含量升高了339.4%；相比于未侵染的植株(DS)葉片的丙二醛含量，侵染的陰性對照植株(BSMV0)葉片的丙二醛含量只升高了3.3%，而侵染TaEF-1α(BSMVTaEF-1α)基因的葉片的丙二醛含量升高了175.6% (圖6)。

圖4 不同處理下小麥葉片相對含水量Fig. 4 The relative water content of wheat leaves in different treatments

圖5 不同處理下植株的葉片相對電導(dǎo)率Fig.5 The relative electric conductivity of plant leaves in different treatments

圖6 不同處理植株的葉片丙二醛含量Fig.6 MDA content of plant leaves in different treatments

3 結(jié)論與討論

干旱能顯著影響小麥的生長發(fā)育和最終產(chǎn)量的形成，前人對小麥抗旱相關(guān)基因及抗旱機(jī)制方面做了大量研究，鑒定出許多干旱脅迫響應(yīng)基因，這些結(jié)果對于探究小麥響應(yīng)的分子機(jī)制和遺傳改良小麥抗旱性具有重要意義[20-21]，但植物響應(yīng)干旱脅迫的過程是一個復(fù)雜的過程，對其分子機(jī)制的解析還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成。本課題組前期利用iTRAQ技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)了一個小麥干旱脅迫響應(yīng)蛋白TaEF-1α。在此基礎(chǔ)上利用VIGS技術(shù)將其進(jìn)行沉默后，對其功能做了進(jìn)一步研究。

VIGS技術(shù)是指攜帶目標(biāo)基因片段的病毒侵染植物后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默、引起表型變化，進(jìn)而根據(jù)表型確定目標(biāo)基因的功能。VIGS技術(shù)在抗病蟲相關(guān)基因的研究中應(yīng)用較多，其中涉及抗白粉病及抗蚜蟲等病蟲害有關(guān)的基因[22-23]。也有研究顯示，該技術(shù)也可用于抗旱脅迫相關(guān)的基因功能研究[24]。本研究利用VIGS技術(shù)對干旱響應(yīng)基因TaEF-1α進(jìn)行沉默。結(jié)果顯示，干旱條件下，該基因表達(dá)量被敲低后的植株表現(xiàn)出葉片下垂的表型，葉片相對含水量也極顯著下降，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量等生理指標(biāo)卻呈現(xiàn)不同幅度的升高趨勢。

水分虧缺會影響作物生命活動的正常進(jìn)行，進(jìn)而影響作物生長，產(chǎn)生作物體內(nèi)生理生化及外部表型的一系列變化[25]。作物遭受干旱脅迫時，葉片的外部形態(tài)會出現(xiàn)葉片下垂的干旱表型，而葉片的相對含水量則能很好地衡量作物的抗旱性。一些抗旱性較強(qiáng)的作物，干旱條件下，葉片下垂程度較輕，葉片能保持比較高的相對含水量[26]。本研究結(jié)果顯示，干旱條件下，相比于正常灌水未侵染的植株(NS)的葉片相對含水量，未侵染植株(DS)和侵染空載體陰性對照植株(BSMV0)的葉片的相對含水量降低的較少，且這2個處理之間的葉片相對含水量沒有明顯差異，葉片未出現(xiàn)明顯的干旱表型，而沉默掉TaEF-1α基因的植株葉片下垂，相對含水量極顯著下降，說明該基因表達(dá)量被敲低后，植株抗旱性下降。

相對電導(dǎo)率是反映植物膜系統(tǒng)狀況的一個重要的生理生化指標(biāo)，植物在受到逆境或者其他損傷的情況下細(xì)胞膜容易破裂，膜蛋白受傷害因而使胞質(zhì)的胞液外滲而使相對電導(dǎo)率增大，電導(dǎo)率越大說明膜蛋白受損傷越嚴(yán)重，作物抗逆性越差。本研究中，相比于正常灌水(NS)植株，未侵染植株(DS)的和侵染空載體陰性對照植株(BSMV0)的葉片相對電導(dǎo)率極顯著升高，說明受干旱誘導(dǎo)相對電導(dǎo)率增加，這與前人的研究結(jié)論一致[27]。相比于未侵染的植株(DS)和侵染BSMV0的陰性對照植株的葉片相對電導(dǎo)率，侵染BSMVTaEF-1α載體的植株葉片相對電導(dǎo)率極顯著升高，這也暗示了沉默該基因后，植株抗旱性顯著下降。

丙二醛是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷。因此，作物在逆境脅迫中生成丙二醛的多少能夠代表膜脂過氧化的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強(qiáng)弱[28]。丙二醛含量越高，說明其植物組織的抗氧化能力越弱，反之，則說明其抗氧化能力強(qiáng)。本研究也得到與前人研究一致的結(jié)論[29]，相比于正常灌水植株的葉片丙二醛含量，未侵染植株(DS)和侵染空載體陰性對照植株(BSMV0)的葉片的丙二醛含量沒有明顯變化，葉片未出現(xiàn)明顯的葉片下垂的表型，而侵染BSMVTaEF-1α載體的植株葉片下垂，丙二醛含量極顯著升高，同樣也說明抗旱性顯著下降。

綜上，干旱條件下，小麥干旱相應(yīng)基因TaEF-1α受干旱誘導(dǎo)極顯著上調(diào)表達(dá)，而利用VIGS技術(shù)將該基因進(jìn)行沉默后，其轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量相比于未沉默植株極顯著下調(diào)，小麥植株也出現(xiàn)葉片下垂的表型，葉片相對含水量極顯著降低，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量極顯著升高。植株抗旱性大幅降低。上述研究結(jié)果表明，該基因可能在小麥響應(yīng)干旱脅迫方面發(fā)揮著重要的作用，有望成為未來遺傳改良小麥抗旱性和分子育種的重要基因資源，值得進(jìn)一步深入研究。

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