王曉銘，劉興偉，郭 丹，吳 冰，朱延旭?

（1.遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省本溪市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 本溪 117000）

遼寧絨山羊液態(tài)精液的保存時間對開展絨山羊人工授精具有重要的影響，保存時間延長，既可以延長精子有效存活時間，又可以進行長距離的輸精配種，從而提高液態(tài)精液的利用效率。通過查閱相關(guān)技術(shù)資料，絨山羊液態(tài)精液正常在0～4℃下保存[1]，可以達到延長精子存活時間的目的，而0℃是保存液態(tài)精液的溫度下限，與0℃以下的低溫保存存在哪些差異？另外，0℃又分為0℃的水和0℃的冰水混合物或0℃的冰等物理狀態(tài)，具體保存液態(tài)精液的效果如何？目前還沒有相關(guān)報導(dǎo)。因此，筆者于2016年秋季進行了在冰水混合狀態(tài)下遼寧絨山羊液態(tài)精液保存方法的試驗研究。

1 試驗材料

1.1 精液來源 試驗用精液為遼寧省遼寧絨山羊科技示范場飼養(yǎng)的一級種用公羊的混合精液，混合后精液的平均活力達70%[2]。

1.2 精液保存溫度環(huán)境的獲取方法

1.2.1 0℃冰水混合物 在冰箱中通過制冷凍成冰水混合物，然后將冰塊壓成碎塊，將超低溫溫度儀的觸頭插入碎冰中，測得實際溫度，如果冰的溫度低于0℃，則攪動冰水混合物，使之達到0℃，冰水混合物達到0℃后，冰與水按4:1混后取150 mL，備用。

1.2.2 0℃的冰 將1.2.1中制成的冰水混合物撈出150 mL，備用。

1.2.3 0℃的水 將1.2.1中制成的冰水混合物的水取出150 mL，備用。

1.2.4 3～5℃的低溫水的制取 在將冰箱保鮮層的溫度調(diào)節(jié)到3～5℃，然后以適當(dāng)?shù)拇翱谘b入一定量的水，在保鮮層內(nèi)降溫，當(dāng)用溫度計測得水的溫度降到3～5℃時即3～5℃的低溫水的制取成功，取出150 mL，備用。

2 試驗方法

2.1 精液采集 公羊精液合格后，即進入試驗準(zhǔn)備期，共5 d時間，采精3次，測定不同時間階段精子活力的變化規(guī)律，由此確定，試驗開始時每3 h測定精子活力，當(dāng)精液保存至第3天后，每2 h測定活力1次，直至精子活力為0[3]。

2.2 精子活力的評定方法 采用肉眼在150～600倍光學(xué)顯微鏡下觀察，并結(jié)合“羊精子全自動分析系統(tǒng)”測定，對試驗公羊的精子活力進行評定，觀測羊精子的環(huán)境溫度為37℃[4]。

2.3 精液稀釋液的配制 用電子天平稱取乳糖、葡萄糖、檸檬酸鈉、EDTA、Tris等分析純藥劑，加入雙次蒸餾水，煮沸降溫后再加入卵黃及抗菌素，配制成遼寧絨山羊液態(tài)精液稀釋液[5]。

2.4 精子頂體完整率的評定方法 精子快速染色液染色，取少量稀釋精液抹片，用95%乙醇鋪滿載玻片固定2～3 min，空氣中自然晾干[6]，干透后水合1～2 min，倒凈液體。滴加試劑一（細胞核染液）鋪滿載玻片染色30 s～2 min，流水洗凈倒凈液體。試劑二（細胞質(zhì)染液）鋪滿載玻片染色20 s～2 min，不要倒丟，立即滴加若干滴增色夜混合作用5 s左右，再用試劑三（增色液）充分沖洗一遍，濾紙吸干。利用精子分析儀分析。隨機選取200個精子，觀察頂體，標(biāo)記頂體不完整的精子。頂體完整率=（200-頂體不完整精子數(shù)/200）×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 遼寧絨山羊液態(tài)精液最佳保存介質(zhì)的確定試驗分為A、B、C、D四組，其中A、B、C為試驗組，D為對照組。A組為0℃冰，B組為0℃冰水混合物，C組為0℃水，D組為3～5℃的低溫水，為保持溫度不明顯波動，每12 h更換一次冰、水或冰水混合物，放入精液后，置于4～5℃的恒溫冰箱中，精液與稀釋液1:1混合，跟蹤對照稀釋后的精液的低溫存活時間、活力50%時回溫38℃存活時間、活力≥0%時存活時間及頂體完整率的變化情況如表1所示。

表1 稀釋后精液在四種介質(zhì)中的活力與存活時間對比Table 1 Comparison of the vitality and survival time of diluted semen in four mediums

由表1可知，活力≥50%存活時間和活力≥0%存活時間，以B組最高，A組次之，C最再次之，D組最低，但A、B、C三組間差異不顯著（P＞0.05）；A、B、C三組與D組比較，差異極顯著（P＜0.01）。活力50%時回溫38℃存活時間，以B組最高，C組次之，A組再次之，但A、B、C三組相互間差異不顯著（P＞0.05）；A、B、C三組與D組比較，差異顯著（P＜0.05）。頂體完整率A、B、C、D各組差異不顯著（P＞0.05）。由此結(jié)果可以初步判定，B組0℃冰水混合物是保存液態(tài)遼寧絨山羊精液的最佳介質(zhì)。

3.2 以 00℃冰水混合物為保存介質(zhì)液態(tài)精液最佳稀釋比例的研究 根據(jù)前面的研究結(jié)論，以0℃冰水混合物為遼寧絨山羊液態(tài)精液的保存介質(zhì)。分別設(shè)立A、B、C、D四組，精液與稀釋液的比例分別為1:1、1:2、1:3、1:4，并跟蹤觀察稀釋后的精液的低溫存活時間、活力50%時回溫38℃存活時間、活力≥0%時存活時間及頂體完整率的變化情況，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，活力≥50%存活時間，以B組最高，D組次之，C組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）?；盍Α?%存活時間，以B組最高，C組次之，D組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）?；盍?0%時回溫38℃存活時間，以B組最高，D組次之，C組再次之，但B、C、D三組間差異不顯著（P＞0.05）；B、C、D三組與A組比較，差異顯著（P＜0.05）。頂體完整率A、B、C、D各組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 以0℃冰水混合物為保存介質(zhì)不同稀釋比例的對比Table 2 Comparison of different dilution ratios at 0℃ice water mixture as storage medium

4 討論

4.1 筆者在設(shè)計試驗時，對精液的稀釋比例以1:1、1:2、1:3、1:4作為各不相同的試驗條件，主要是考慮到精液的稀釋比例不同時，會引起稀釋液成份濃度在稀釋后的精液中的濃度不同，從而引起精子對溫度的降低的適應(yīng)能力不同，最終引起精子結(jié)構(gòu)的損壞程度可能不同，但是由于試驗條件的限制，沒有對其他比例的稀釋精液進行試驗，需以后做其他試驗加以完善。

4.2 0℃冰、0℃冰水混合物、0℃水的試驗效果均優(yōu)于3～5℃的低溫水，說明0℃以上的環(huán)境下，精子仍存在能量消耗，為驗證這一結(jié)論，筆者觀察了3～5℃條件下精子的運動狀態(tài)。具體方法是將光學(xué)顯微鏡和精液置于3～5℃的低溫平衡柜內(nèi)，待溫度穩(wěn)定后對精子進行觀察，發(fā)現(xiàn)低溫下精子仍有擺動、顫動和小量的前進運動，據(jù)此推測，精子運動消耗能量，同時精子代謝仍在進行，如果精子保存時間較長，精子代謝和運動的能量消耗是不可忽視的。

4.3 由于冰水混合物與0℃冰、0℃水比較，具有溫度穩(wěn)定、吸熱量多、制取及控溫容易等優(yōu)點，因此，可作為生產(chǎn)實踐中精液降溫的推廣方法。

4

4.4 本試驗比較了部分的精液技術(shù)指標(biāo)，而精子的質(zhì)膜完整性、畸形率、代謝產(chǎn)物的變化、輸精受胎率等指標(biāo)沒有進行相關(guān)試驗進行驗證，只是對人工授精技術(shù)環(huán)節(jié)的研究起到了一定的拋磚引玉的作用，有待于今后開展更為系統(tǒng)深入的研究。

[1] 劉興偉，陳寧.絨山羊液態(tài)精液稀釋技術(shù)[J].黑龍江動物繁殖，2016，24（2）：29-31.

[2] 張世偉，楊術(shù)環(huán)，宋先忱，等.絨山羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程（NY/T2893-2016）[S].

[3] 楊術(shù)環(huán)，宋先忱，王世泉，等.遼寧絨山羊人工授精技術(shù)操作規(guī)程（DB21/T 24342015）[S].

[4] 張世偉，等.遼寧絨山羊生產(chǎn)實用技術(shù)[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古出版社，2003.

[5] 傅文棟，王新平.家畜精液品質(zhì)評定項目及其方法[J]. 新疆畜牧業(yè)，2010，12：53-55.

[6] 張世偉，宋先忱，朱延旭，等.遼寧絨山羊細管冷凍精液研究[J]. 中國畜牧雜志，2006，42（3）：23-25.