陳 通，朱育星，蔡雯祎，楊琦玥，鄧志和，蘭道亮

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

沙門菌屬于革蘭陰性菌，在自然界分布極廣，且菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜[1]，是能引起人和多種動物致病的病原菌。在世界范圍內(nèi)，由沙門菌導(dǎo)致的食源性疾病一直排在細(xì)菌性食物中毒的首位[2]。牦牛沙門菌病，也稱為牦牛副傷寒(“小牛瘟”)，沙門菌主要在牦牛腸道生長繁殖，可通過腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，并通過血液循環(huán)，導(dǎo)致全身感染，引起腹瀉、發(fā)熱及腸道炎癥反應(yīng)[3]。本病在我國牦牛繁衍區(qū)廣泛流行，幼齡牦牛和成年牦牛均能感染發(fā)病和造成死亡。其中對幼齡牦牛危害最為嚴(yán)重，致死率高，嚴(yán)重地危害著牦牛業(yè)的健康發(fā)展[4-6]。目前，尚無針對牦牛沙門菌病的有效疫苗，且不同血清型間無交叉免疫保護(hù)力，同時抗生素等藥物治療極易誘使沙門菌產(chǎn)生耐藥性，使得牦牛沙門菌病始終未能得到有效防控。此外，對于沙門菌免疫機制的研究多集中于雞、鼠等常規(guī)實驗動物，目前對于牦牛沙門菌的研究多集中于病原體本身[7-8]，對牦牛機體抵御沙門菌感染的相關(guān)免疫機制的研究尚未見任何報道。

同時，對沙門菌免疫機制的研究多為單一基因或通路。由于宿主抵御病原體感染的免疫反應(yīng)是一個復(fù)雜的作用機制，涉及許多分子及其信號通路，而這些分子及其信號通路又受許多基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，所以僅從單個或少數(shù)基因?qū)用媸菬o法深入挖掘機體抗感染免疫信息的，而在組學(xué)層面上加以描述才能更加有效地理解其中的作用機制[9]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，在功能基因組學(xué)層面上對感染后的組織或細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)基因，已逐漸被公認(rèn)為是鑒定機體抗感染免疫相關(guān)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個有效工具[10-11]。同時隨著近期牦牛全基因組的釋放[12]，為牦牛的相關(guān)研究提供了可操作的藍(lán)圖。

鑒于此，本研究選取了高致病性的牦牛源御成門沙門菌作為模式病原體[13]，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)高通量技術(shù)篩選牦牛外周免疫器官脾感染沙門菌后的差異表達(dá)基因，并通過關(guān)聯(lián)分析鑒定出牦牛抗沙門菌感染相關(guān)免疫基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步了解牦?？垢腥鞠嚓P(guān)分子免疫機制及牦牛重大疫病的分子抗病育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牦牛源御成門沙門菌swun3736菌株由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室于2012年從牦牛糞便中分離,血清型經(jīng)四川省動物疫病預(yù)防控制中心鑒定。健康1月齡犢牦牛由西南民族大學(xué)青藏基地提供。

1.2 菌株培養(yǎng)

將御成門沙門菌菌株于37 ℃條件下，在SS平板劃線分離培養(yǎng)，挑選單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物感染與樣本采集

選取18只犢牛，用牛屬ELISA(賽默飛公司)試劑盒對其進(jìn)行常見疫病細(xì)菌(沙門菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌)和病毒(腹瀉-黏膜病病毒、輪狀病毒)的相關(guān)抗體檢測，排除攜帶上述病原體的可能性。根據(jù)預(yù)試驗癥狀，選擇12、24、48 h三個時間取樣。將18只犢牛分為試驗組和對照組(各9頭)，分別于頸靜脈注射10 mL沙門菌菌液(約1×108CFU)和生理鹽水，然后分別在感染后12、24、48 h三個時間點隨機選取試驗組和對照組各3只犢牛，采集其脾樣本，放入液氮中保存。

1.4 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用TRIzol(Life Technologies公司，美國)試劑提取脾樣本RNA，提取的RNA使用DNAse I(TaKaRa公司，大連)消化DNA后，用Oligotex mRNA小量提取試劑盒(Qiagen公司，德國)分離純化mRNA，然后使用Nanodrop ND-1000分光光度計對RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行測定。用打斷試劑在恒溫混勻儀中對純化的mRNA進(jìn)行片段化，以打斷的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，純化和配對末端修復(fù)后，在cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，進(jìn)行片段大小選擇后用PCR擴增；構(gòu)建好的cDNA文庫經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100及 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后，在Illumina HiSeqTM2500平臺上對文庫進(jìn)行測序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

對Hiseq 2500測序產(chǎn)生的原始讀數(shù)進(jìn)行QC測試后，通過去除接頭序列、空序列及低質(zhì)量測序序列(≤Q20質(zhì)量值)，將原始讀數(shù)過濾為凈測序序列(Clean reads)。使用HISAT2軟件將凈測序序列比對到牦牛基因組序列上，根據(jù)每條read在基因組上的位置統(tǒng)計染色體的測序深度。使用Bowtie2軟件將凈測序序列比對到參考基因序列上，對測序的整體質(zhì)量進(jìn)行評估。應(yīng)用Blast2 GO程序?qū)⒈葘ι系幕蚺cGO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，然后應(yīng)用WEGO程序?qū)@些基因涉及的主要生物學(xué)功能進(jìn)行GO分類注釋。通過與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫比對，對這些基因涉及的信號通路或代謝途徑(Pathway)進(jìn)行分析。最后進(jìn)行差異基因網(wǎng)絡(luò)互作分析，對18個樣本的所有差異基因進(jìn)行Soft power 值的篩選，然后通過以TOM矩陣進(jìn)行距離的劃分，得到基因之間的距離，再依照距離進(jìn)行模塊的劃分，根據(jù)WGCNA權(quán)重網(wǎng)絡(luò)分析得到各模塊內(nèi)基因間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，通過Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖繪制。

2 結(jié) 果

2.1 RNA高通量測序基本數(shù)據(jù)分析

本研究對試驗組和對照組三個時間點共計18個樣本進(jìn)行測序并通過質(zhì)控。核苷酸組成分析顯示，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)總GC含量為54.62%。堿基組成和質(zhì)量分析表明，原始測序數(shù)據(jù)的堿基組成情況良好。高質(zhì)量測序序列的平均比例為97.12%，此結(jié)果說明測序質(zhì)量良好。將Clean reads比對到參考基因上，平均映射比率為80.17%，且測序序列均勻地覆蓋在參考基因上，說明此次序的整體質(zhì)量良好、測序數(shù)據(jù)隨機性良好，可用于后續(xù)的分析。

2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計

試驗組與對照組三個時間點差異基因篩選統(tǒng)計顯示，12 h篩選出77個差異表達(dá)基因，其中48個為上調(diào)，29個為下調(diào)。24 h篩選出134個差異表達(dá)基因，其中55個表現(xiàn)為上調(diào)，79個表現(xiàn)為下調(diào)。48 h篩選出202個差異表達(dá)基因，其中82個表現(xiàn)為上調(diào)，120個表現(xiàn)為下調(diào)。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能及pathway顯著性富集分析

GO分析表明(表1)，試驗組與對照組12 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3個大類36個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是代謝過程、生物調(diào)節(jié)及生物過程的調(diào)控。試驗組與對照組24 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3 個大類44個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是單一有機體過程及生物調(diào)節(jié)。試驗組與對照組48 h差異表達(dá)基因涉及生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3個大類46個小類，在生物過程類別中，最為富集的是細(xì)胞過程，其次是單一有機體過程及生物調(diào)節(jié)。

表1各時間點生物學(xué)過程前十富集GO分類

Table1ClassificationofthefirsttenenrichedGObeforethebiologicalprocess

樣品Sample基因功能Genefunction基因數(shù)Numberofgenes對照組12hvs試驗組12hBiologicalregulation2412h-dzvs12h-SYCellularcomponentorganizationorbiogenesis13Cellularprocess37Localization13Metabolicprocess27Negativeregulationofbiologicalprocess12Positiveregulationofbiologicalprocess24Responsetostimulus19Signaling12Single-organismprocess32對照組24hvs試驗組24hBiologicalregulation58

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

KEGG注釋結(jié)果表明，試驗組與對照組12 h差異基因涉及96條通路, 富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有5條，富集前3的通路與能量代謝有關(guān)。試驗組與對照組24 h差異基因涉及164條通路,富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有9條，其他通路多與疾病相關(guān)。試驗組與對照組48 h差異基因涉及188條通路，富集前20的通路中，與感染、免疫相關(guān)的通路有3條，有6條通路與癌癥相關(guān)，其他通路多與疾病相關(guān)(表2)。

2.4 差異表達(dá)基因WGCNA分析

WGCNA分析顯示，處于網(wǎng)絡(luò)樞紐的基因共66個，處于網(wǎng)絡(luò)中心的基因是SCOC和NOCT(圖1)。

3 討 論

脾免疫是動物抵御外界病原體感染重要機制，在機體抗感染免疫中具有重要地位。本研究以牦牛源御成門沙門菌為模式病原體，采用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)RNA-Seq對感染牦牛脾組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出差異表達(dá)基因，在組學(xué)層面上探討了牦牛脾細(xì)胞與御成門沙門菌的互作機制。

3.1 差異表達(dá)基因的GO分析

試驗組和對照組進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO分析顯示，注射沙門菌12 h后，生物學(xué)過程的富集類別多與細(xì)胞對于病原的反應(yīng)相關(guān)，分子功能中最為富集的是綁定類別及催化類別，推測綁定類別及催化作用在該時期的機體抗感染機制中有著重要的作用。

24 h后，宿主發(fā)生炎癥反應(yīng)，生物過程類別與12 h時幾乎一致，但增加了細(xì)胞殺傷。分子功能類別增加了4個與信號傳遞相關(guān)的類別，推測該時期細(xì)胞的凋亡及信號傳遞十分重要。

48 h后，試驗組臨床表現(xiàn)和病變較對照組更為劇烈，功能類別與24 h的分析沒有太大區(qū)別，但差異基因數(shù)量顯著增加，分子功能類別增加了趨化因子活性和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，缺少了結(jié)構(gòu)分子活性，推測該時期分子的趨化作用及核酸轉(zhuǎn)錄對機體抗感染機制非常重要。

3.2 差異表達(dá)基因的KEGG分析

差異表達(dá)基因KEGG分析顯示，注射沙門菌12 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有TGF-β信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD-like受體信號通路、吞噬體、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用。其中，TGF-β信號通路、NOD-like受體信號通路所涉及的差異基因都表現(xiàn)為下調(diào)，包括Rbx1、RANTES、BMP。Rbx1是E3泛素連接酶的重要組成部分，通過促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的及時降解來激活E3泛素連接酶并參與泛素化過程，同時泛素連接酶E3還涉及多種疾病的發(fā)病機制[14]。RANTES是趨化性細(xì)胞因子CC亞族成員，能趨化或刺激多種白細(xì)胞。這些基因的下調(diào)推測是受到了沙門菌的抑制，具體機制還不明確，有待進(jìn)一步研究。PI3K-Akt信號通路和吞噬體涉及的差異基因表現(xiàn)為上調(diào)，這些差異基因包括Gβγ和F-actin。Gβγ與Gα亞基組成的異三聚體G蛋白能傳遞G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的信號，從而調(diào)節(jié)激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等的生理反應(yīng)[15-16]。F-actin是細(xì)胞骨架的成分之一，對CD4+T細(xì)胞形態(tài)的維持、物質(zhì)的運輸、細(xì)胞的運動，以及病毒侵染等過程具有重要作用[17]。這些基因的上調(diào)，說明宿主的免疫細(xì)胞開始激活分化。

沙門菌感染的一個重要特征是腸道炎癥[3]，此時通路炎性腸病也有富集表現(xiàn)，其涉及的差異基因為TCR、NOD2，TCR和NOD2都是重要的天然免疫受體。TCR/CD3復(fù)合物能誘導(dǎo)T細(xì)胞激活、刺激誘導(dǎo)NF-κB信號通路，此時大部分TCR上調(diào)，是感染初期宿主發(fā)現(xiàn)沙門菌入侵后的快速免疫應(yīng)答。有少量TCR表現(xiàn)為下調(diào)，猜測可能是沙門菌為躲避免疫系統(tǒng)監(jiān)視而產(chǎn)生的抑制作用。

此外，本階段最為富集的通路為氧化磷酸化通路、非酒精性脂肪肝通路和心肌收縮通路，這三條通路涉及的差異基因較為相似，主要是細(xì)胞色素c氧化酶，其中COX3和COX7c表現(xiàn)為下調(diào)，其余差異基因都表現(xiàn)為上調(diào)。細(xì)胞色素c氧化酶上調(diào)能促進(jìn)線粒體的氧化磷酸化作用，而氧化磷酸化系統(tǒng)是細(xì)胞能量產(chǎn)生的最終生化途徑，能為部分免疫細(xì)胞的分化提供能量。大量研究表明，病原體感染宿主細(xì)胞后對宿主能量代謝的影響主要是對氧化磷酸化作用的抑制。COX3和COX7c的下調(diào)，推測是受到了沙門菌的抑制。

24 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有細(xì)胞因子受體相互作用、TNF信號通路、趨化因子信號通路、Toll-like受體信號通路、沙門菌感染、NOD-like受體信號通路、NF-κB信號通路、Jak-STAT信號通路、細(xì)胞凋亡。分析它們所涉及的差異基因，發(fā)現(xiàn)此時參與免疫的主要是趨化因子。趨化因子能讓細(xì)胞遷移至炎性部位，且能與其受體結(jié)合參與多種病理過程，對免疫細(xì)胞分化有重要作用[18]。其中，涉及到大多數(shù)通路的是IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子，這些炎性因子都表現(xiàn)為上調(diào)。IL-1能激活抗原遞呈細(xì)胞、促進(jìn)T、B細(xì)胞生長及免疫球蛋白的合成[19]。IL-6、IL-8能調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞趨化因子的生成，促使中性粒細(xì)胞遷移至感染局部，參與炎癥反應(yīng)[20-21]。IL-1β和TNF-α可以誘導(dǎo)NF-κB通路，促進(jìn)炎性因子的分泌，IL-1和TNF-α還能激活凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。這些炎性因子的上調(diào)，說明宿主正處于炎癥階段，以此抵抗沙門菌。

有研究表明，Toll樣受體信號通路中的TLR4能識別革蘭陰性菌并影響IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子的釋放[23-24]，但此時試驗組與對照組相比，TLR4并無明顯差異，而該通路的下游基因IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等都顯示為上調(diào)，推測TLR4可能在此階段之前發(fā)生過變化，但本次研究并未捕捉到。在24 h階段，CCL2也涉及多個富集通路，CCL2是在IL-8、TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌，并積極誘導(dǎo)免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的趨化因子[25]。本階段IL-8、TNF-α都表現(xiàn)為上調(diào)，但CCL2卻表現(xiàn)為下調(diào)，推測沙門菌對其有抑制作用，具體機制有待進(jìn)一步研究。

48 h后，與感染、免疫相關(guān)的富集通路有PI3K-Akt信號通路、吞噬體等。其中PI3K-Akt信號通路和吞噬體最為富集且涉及的差異基因眾多。這兩條通路涉及的差異基因都包含了TLR2，TLR2是TLRs家族的成員之一，是表達(dá)于天然免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等表面最重要模式識別受體，能刺激炎癥因子的合成，參與機體免疫[26]，此時TLR2表現(xiàn)為下調(diào)，推測沙門菌感染對其有抑制作用，具體機制有待進(jìn)一步研究。此外，PI3K-Akt信號通路涉及的差異基因還包括IL6、G-CSF、IL2α、NF-κB、PDGF-B、PDGFRA、CSF-1R等，除CSF-1R表現(xiàn)為下調(diào)外，其它基因都表現(xiàn)為上調(diào)，其中，NF-κB基因?qū)C體免疫十分重要。NF-κB基因可在TLRs識別到細(xì)菌入侵后被激活[27]，其主要作用是對免疫和炎癥作用的調(diào)控，PI3K-Akt信號通路中的促炎癥因子IL6、G-CSF、IL2α等都在NF-κB的調(diào)控范圍之內(nèi)。IL6、G-CSF、IL2α等促炎癥因子還可以促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)生[28-29]。此外，IL-1β、TNF-α還可以通過激活或抑制NF-κB的活性來維持整個炎癥作用有效、有限的發(fā)生，以達(dá)到適度炎癥促進(jìn)免疫的目的，避免過度炎癥引發(fā)自身的免疫疾病或炎癥相關(guān)疾病[30-31]。吞噬體所涉及的差異基因還包括大量的整合素，這是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的黏附分子受體，其主要功能為細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞的生長和分化、炎癥、創(chuàng)傷愈合等[32]。然而，此時這些整合素大部分顯示為下調(diào)，其具體機制有待進(jìn)一步研究。

此外，48 h階段的富集通路中出現(xiàn)了許多與癌變相關(guān)的通路，如病毒致癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素、膀胱癌、急性骨髓性白血病等，這些癌癥相關(guān)通路大多都包含NF-κB基因，NF-κB和其信號通路中的大部分激活因子被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[33]。

此時氧化磷酸化通路的差異基因QCR10、COX1、COX7B、COX7C全部顯示為下調(diào)，推測此時宿主的能量代謝系統(tǒng)可能受到了抑制。

3.3 WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL-1A、IL-1B、IL-2RA、IL-6、IL-23A、TNF、CXCR5、CXCL3、CXCL8、CCL5、CCL20、CSF等都顯示為富集，這些基因可以在前文KEGG分析的富集通路中找到，驗證了KEGG分析的結(jié)果。SCOC和NOCT處于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，說明這兩個基因與其他富集基因的相關(guān)性最高。SCOC是一種高爾基體蛋白，通過與ARL1相互作用參與高爾基體運輸，SCOC能促進(jìn)自噬體的形成，自噬可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞代謝功能[34]。NOCT是一種脫腺苷酶，通過參與代謝脂肪基因轉(zhuǎn)錄后的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)牽涉脂質(zhì)代謝的許多方面。NOCT在脂質(zhì)代謝、脂肪形成、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、炎癥和骨生成中發(fā)揮重要作用[35]。SCOC和NOCT的富集說明細(xì)胞代謝功能在整個免疫過程中起著重要作用。

4 討 論

以牦牛源御成門沙門菌為模式病原體，用RNA-Seq測序技術(shù)對感染牦牛的脾轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出牦牛感染御成門沙門菌后脾細(xì)胞的差異表達(dá)基因，在組學(xué)層面上探討了牦牛脾細(xì)胞與沙門菌的分子互作機制，為進(jìn)一步研究高原動物的免疫機制提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] 黃素珍, 杜元釗, 張艷紅. 檢測腸炎沙門氏菌ELISA方法的建立與應(yīng)用研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2006, 28(2): 196-200.

HUANG S Z, DU Y Z, ZHANG Y H. Establishment and application of ELISA method for detectingSalmonellaSPP [J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine, 2006, 28(2): 196-200. (in Chinese)

[2] 陳建林, 劉明輝. 細(xì)菌性食物中毒流行趨勢及預(yù)防對策[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2002, 12(4): 481.

CHEN J L, LIU M H. The epidemic trend and preventive measures of bacterial food poisoning [J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, 2002, 12(4): 481. (in Chinese)

[3] RAGHUNATHAN A, REED J, SHIN S, et al. Constraint-based analysis of metabolic capacity ofSalmonellatyphimuriumduring host-pathogen interaction [J /OL].BmcSystBiol, 2009 (3): 38. [2018-02-06]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2678070/pdf/1752-0509-3-38.pdf.

[4] 樊萬庚, 張長德, 齊厲生, 等. 牦牛副傷寒調(diào)查研究報告[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 1981, 7(5): 26-27.

FAN W G, ZHANG C D, QI L S, et al. Investigation report on calf paratyphoid fever [J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine, 1981, 7(5): 26-27. (in Chinese)

[5] 黃南州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所. 牛副傷寒氧化鋁雙價菌苗試驗報告[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志, 1982(4): 30-35.

Huangnan State Animal Husbandry Department. Test report of the aluminium oxide bivalent bacterial seedlings on bovine paratyphoid [J].ChineseQinghaiJournalofAnimalandVeterinarySciences, 1982(4): 30-35. (in Chinese)

[6] 左永讓. 牦牛副傷寒的診斷報告[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志, 1985(5): 24-25.

ZUO Y R. Diagnosis report of yak paratyphoid fever [J].ChineseQinghaiJournalofAnimalandVeterinarySciences, 1985(5): 24-25. (in Chinese)

[7] YUE H, ZHU X X, ZHANG B, et al. Emergence of the virulence plasmid inSalmonellaonarimonandSalmonellablegdamfrom yak [J].VetMicrobiol, 2013(1): 162: 296-297.

[8] 儲 倩, 朱曉霞, 岳 華, 等. 川西北牦牛沙門氏菌的健康帶菌調(diào)查及藥敏實驗[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2011(1): 24-25, 28.

CHU Q, ZHU X X, YUE H, et al. Epidemiological investigation and drug sensitive test ofSalmonellain yak from northwest Sichuan [J].SichuanAnimal&VeterinarySciences, 2011(1): 24-25, 28. (in Chinese)

[9] MACHUGH D E, GORMLEY E, PARK S D, et al. Gene expression profiling of the host response toMycobacteriumbovisinfection in cattle [J].TransboundEmergDis, 2009, 56(6-7): 204-214.

[10] RISMANI-YAZDI H, HAZNEDAROGLU B Z, BIBBY K, et al. Transcriptome sequencing and annotation of the microalgaeDunaliellatertiolecta: pathway description and gene discovery for production of next-generation biofuels [J/OL].BmcGenomics, 2011, 12: 148. [2018-02-06]. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3061936/pdf/1471-2164-12-148.pdf.

[11] RADFORD A D, CHAPMAN D, DIXON L, et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology [J].JGenVirol, 2012, 93 (Pt9): 1853-1868.

[12] QIU Q, ZHANG G, MA T, et al. The yak genome and adaptation to life at high altitude [J].NatGenet, 2012, 44(8): 946-949.

[13] 雷占東, 張 斌, 岳 華, 等. 一株牦牛源御成門沙門菌對小鼠的致病性[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2015, 46(2): 339-343.

LEI Z D, ZHANG B, YUE H, et al. The study on pathogenicity of a yakSalmonellaonarimonisolates in mice[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2015, 46(2):339-343. (in Chinese)

[14] JIA L, BICKEL J S, WU J, et al. RBX1 (RING box protein 1) E3 ubiquitin ligase is required for genomic integrity by modulating DNA replication licensing proteins [J].JBiolChem, 2011, 286(5): 3379-3386.

[15] KHAN S M, SLENO R, GORA S, et al. The expanding roles of Gβγ subunits in G protein-coupled receptor signaling and drug action [J].PharmacolRev, 2013, 65(2): 546-577.

[16] YAN J, MIHAYLOV V, XU X, et al. A Gβγ effector, ElmoE, transduces GPCR signaling to the actin network during chemotaxis [J].DevCell, 2012, 22(1): 92-103.

[17] BURKHARDT J K, CARRIZOSA E, SHAFFER M H. The actin cytoskeleton in T cell activation [J].AnnuRevImmunol, 2008, 26: 233-259.

[18] 馬小彤. 趨化因子與腫瘤和炎癥[J]. 白血病·淋巴瘤, 2005, 14(5): 287-290.

MA X T. Chemokines with tumors and inflammation [J].JournalofLeukemia&Lymphoma, 2005, 14(5): 287-290. (in Chinese)

[19] HURME M, SANTTILA S. IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) plasma levels are co-ordinately regulated by both IL-1Ra and IL-1beta genes [J].EurJImmunol, 2015, 28(8): 2598-2602.

[20] HIRANO T. Interleukin 6 and its receptor: ten years later [J].IntRevImmunol, 1998, 16(3-4): 249-284.

[21] AHMED N S, ALKHAYAT A M, ABDULLAH F T. Interleukins IL-6, IL8, IL10 and tumor necrosis factor TNF expression in human infected withGiardiaduodenalis[J].AmJMedMedSci, 2015, 5(1): 15-19.

[22] WANG L, DU F, WANG X. TNF-alpha induces two distinct caspase-8 activation pathways [J].Cell, 2008, 133(4): 693-703.

[23] POLTORAK A, HE X, SMIRNOVA I, et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/l0ScCr mice: mutations in Tlr4 gene [J].Science, 1998, 282(5396): 2085-2088.

[24] HOSHINO K, TAKEUCHI O, KAWAI T, et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product [J].JImmunol, 1999, 162(7): 3749-3752.

[25] QIAN B Z, LI J, ZHANG H, et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis [J].Nature, 2011, 475(7355) : 222-225.

[26] AKIRA S, TAKEDA K, KAISHO T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity [J].NatImmunol, 2001, 2(8): 675-680.

[27] KAWAI T, AKIRA S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors [J].NatImmunol, 2010, 11(5): 373-384.

[28] LUSTER A D. Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation [J].NEnglJMed, 1998, 338(7): 436-445.

[29] FELDMANN M, BRENNAN F M, ELLIOTT M J, et al. TNF alpha is an effective therapeutic target for rheumatoid arthritis [J].AnnNYAcadSci, 1995, 766: 272-278.

[30] LI Q T, VERMA I M. NF-κB regulation in the immune system [J].NatRevImmunol, 2002(2): 725-734.

[31] BLONSKA M, SHAMBHARKAR P B, KOBAYASHI M, et al. TAK1 is recruited to the tumor necrosis factor-α (TNF-α) receptor 1 complex in a receptor-interacting protein (RIP)-dependent manner and cooperates with MEKK3 leading to NF-κB activation [J].JBiolChem, 2005, 280(52): 43056-43063.

[32] MOSER M, LEGATE K R, ZENT R, et al. The tail of integrins, talin, and kindlins [J].Science, 2009, 324(5929): 895-899.

[33] PCRKINS N D. The diverse and complex roles of NF-κB subunits in cancer [J].NatRevCancer, 2012, 12(2): 121-132.

[34] JOACHIM J, WIRTH M, MCKNIGHT N C, et al. Coiling up with SCOC and WAC: two new regulators of starvation-induced autophagy [J].Autophagy, 2012, 8(9): 1397-1400.

[35] STUBBLEFIELD J J, TERRIEN J, GREEN C B, et al. Nocturnin: at the crossroads of clocks and metabolism [J].TrendsEndocrinolMetab, 2012, 23(7): 326-333.