伍佰鑫 ，文平，謝農(nóng)村，燕海峰 ** （編譯）

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南佳牛牧業(yè)科技有限公司，湖南 長沙 410000)

在家禽面臨意想不到的疾?。ɡ缜萘鞲校┐罅餍袝r，（冷凍）保存現(xiàn)有種群的遺傳多樣性，并在未來通過回交重新建立種群，是家禽業(yè)生物安全保障、預(yù)防禽種（特別是珍稀品種）遺傳資源減少或流失的關(guān)鍵措施。目前對雞卵母細(xì)胞或早期胚胎冷凍保存的難題仍未解決；公雞精子可通過精液冷凍保存，但純靠精液冷凍保存不能保存雞的全部基因，因為母雞是攜帶W性染色體的配偶；另一種方法是冷凍保存性腺組織，通過器官移植到寄主雞體，生產(chǎn)出功能正常的精液和卵母細(xì)胞。但是，攜帶供體睪丸組織的公雞寄主，與攜帶供體卵巢組織的母雞寄主交配，仍不能生產(chǎn)出純種供體雞的后代。

雞的原始生殖細(xì)胞 （PGCs，早期生殖細(xì)胞前體）在雞的發(fā)育期間很早就形成，這些細(xì)胞可以從胚胎循環(huán)系統(tǒng)中分離出來，再引入寄主雞胚胎的循環(huán)系統(tǒng)中，“殖民化”寄主的性腺，同一性別的寄主雞（后代）可生產(chǎn)出切實可行的供體雞精子和卵子。分離出少量的PGCs，通過體外培養(yǎng)增加其數(shù)量后再冷凍保存，比直接分離出足夠多的PGCs后再冷凍要容易一些 （因為PGCs分離技術(shù)難度較大）。英國對雞的原生殖細(xì)胞凍存并重建種群的研究，對于中國禽類遺傳資源保存具有較大的參考價值。

1 研究方法[1]

1.1 總體概述 從單個供體雞胚胎分離出血液，體外培養(yǎng)PGCs至10萬個以上、多等分冷凍。一段時間之后，解凍1小瓶PGCs，培養(yǎng)幾天以便PGCs蘇醒。將PGCs注入寄主雞胚胎，孵化至出雛，性別鑒定，含有注射的供體雞PGCs的、同性別的小雞（后1代）飼養(yǎng)至性成熟，公母雞交配測試（產(chǎn)蛋孵化，）有些后（2）代雞就會攜帶供體雞的遺傳基因（圖 1，小雞 B）。

圖1 通過冷凍保存的供體雞原始生殖細(xì)胞（PGCs）重建供體雞后代

1.2 操作步驟 在國家禽類研究所有5個近交度高的白來航雞品系，這些雞是通過回交篩選出主要組織學(xué)復(fù)合物（MHC）單倍型的品系，它們對許多禽類病毒和細(xì)菌病原體的易感性各不相同。6型近交品系對馬立克病毒的敏感性不同，O型近交品系缺乏內(nèi)源性禽白血病病毒，N型和P型近交品系對MD（肌肉萎縮癥）的抗性不同，還有W型威康（Wellcome）近交品系，總共 5個品系（6、O、N、P、W）。這些雞作為幾個國家的育種雞群維持了幾十年，已用于疫苗開發(fā)和幾種病原體的抗病性基因鑒定。雖然與遠(yuǎn)交品系的遺傳基因相比減少較多，但這些近交品系（受精率低，25%～75%）仍然包含某些遺傳變異。從這5個品系創(chuàng)建PGCs冷凍庫，每個品系15～32個個體，每個性別的品系至少5個個體。

PGC培養(yǎng)基配方：1×B-27補(bǔ)充物、2.0mM GlutaMax培養(yǎng)基（含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺穩(wěn)定形式的二肽，可防止長期培養(yǎng)過程中谷氨酰胺的降解和氨的積累）、1×NEAA（細(xì)胞培養(yǎng)添加物，含有7種非必需氨基酸；降低細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞自身生產(chǎn)非必需氨基酸的副作用）、0.1 mM β-巰基乙醇、1×核苷、1.2mM 丙酮酸鹽 （或酯）、0.2%卵清蛋白（∑或 σ）、0.2%肝素鈉（∑或σ）5μg/ml添加到禽類DMEM（杜爾伯科必需培養(yǎng)基）、一種定制的基礎(chǔ)液或改進(jìn)的DMEM（250 mosmol/L、12.0mM葡萄糖、無氯化鈣）。使用之前再添加25ng/ml人用活化素A、4ng/ml人用成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)和0.2%雞血清。

PGCs采集、培養(yǎng)和凍存：從發(fā)育至階段15～16（孵化2.5d）的雞胚分離血液，取1.0μl血液置于48孔培養(yǎng)皿（內(nèi)有300μl培養(yǎng)基）；每隔2d更換三分之一的培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1.0×105時，每隔 2d更換整個培養(yǎng)基；細(xì)胞按（2～4×105個/ml培養(yǎng)基）的速度增殖；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有4%DMSO（二甲基亞砜）和5%雞血清的禽類DMEM中，冷凍并-150°C保存。供體雞胚胎的分離及性別鑒定按Macdonald 等（2010）報道的方法[2]操作。

生殖系傳遞效率檢測：6型品系中公雞系和母雞系的細(xì)胞在FA（葉酸）細(xì)胞培養(yǎng)基中增殖，冷凍保存1星期；解凍細(xì)胞；培養(yǎng)幾周的時間并計數(shù)。雞蛋孵化2.5d（Hamburger和Hamilton劃分的雞胚發(fā)育階段16）、銳端開窗、5000～6000個公雞系或母雞系的細(xì)胞注射到背側(cè)主動脈、用帕拉膠膜（石蠟封口膜）密封窗口、銳端向下繼續(xù)孵化至出雛。雛雞飼養(yǎng)至性成熟，從成年嵌合體雞精液中提取基因組DNA，先在多聚酶鏈反應(yīng) (PCR)中篩選，再用鐳221引物鑒定精液中190bp等位基因。一只寄主公雞與野生型母雞交配，（后1代）野生型公雞采精，輸入寄主母雞；（后2代雞蛋）孵化期間采集尿囊膜和血液樣本。用QIAamp DNA套件（Qiagen，德國）準(zhǔn)備基因組 DNA，通過微衛(wèi)星分析，鑒定源于供體雞PGC的后代。

微衛(wèi)星分析：運(yùn)用以下引物的源生物科學(xué)進(jìn)行分析：

鐳221——CCTTTATCCACTCTTCATGCAC；TGCATAAATTCCATGGGTAAGC。

鐳258——CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG；AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC。

MCW145——ACTTTATTCTCCAAATTTGGCT；AAACACAATGGCAACGGAAC。

運(yùn)用ABI棱鏡3730遺傳分析儀分析多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)物。

2 研究結(jié)果[1]

2.1 供體雞品系公母PGC冷凍保存 受精蛋孵化 2.5d（階段 16），從（雞胚）背主動脈吸出 1μl血液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿培養(yǎng)2～3周齡；在此期間，血液細(xì)胞溶解，PGCs以單個分散細(xì)胞的形式存在于培養(yǎng)孔中（圖2）。在3周末，給包含10萬個以上細(xì)胞的培養(yǎng)皿打分，作為源于供體雞品系的陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞另外培養(yǎng)1周，使其增殖（每0.5ml培養(yǎng)基10萬個細(xì)胞）；按每瓶50萬～10萬個細(xì)胞的等份進(jìn)行冷凍和保存。

圖2 供體雞品系單個胚胎培養(yǎng)的PGCs

從表1可知，從單個胚胎開始的培養(yǎng)皿數(shù)有203個，該數(shù)字是大約630個蛋孵化的結(jié)果。這個33%的啟動率是因為孵化中的無精蛋；雞蛋運(yùn)輸和儲存過程中損失了受精蛋；近交系雞胚發(fā)育異常；品系間胚胎發(fā)育階段的差異（小于階段15或超過階段17）不便采集血液樣本。203個培養(yǎng)皿中，有133個培養(yǎng)皿中的PGCs用于冷凍 （共478小瓶=222+256），供體雞基因傳遞率66.8%（5個總計數(shù)%相加再除以5），源于供體雞公雞的基因傳遞率 （69.6%）與源于供體雞母雞的基因傳遞率（65.4%）類似，表明供體雞公雞和母雞的基因都能傳遞。根據(jù)FAO（1998）維持一個種群最少需要公母各13個基因，本次試驗中的6型品系公母雞都有27個基因、N系有 29個、O系有 30個、P系有32個、W系有15個（需要進(jìn)一步培養(yǎng)，再生出一個遠(yuǎn)交種群）。冷凍供體雞品系公母的單基因型PGC見表1。

表1 冷凍供體雞品系公母的單基因型PGC

2.2 遠(yuǎn)系繁殖傳送供體雞品系的PGCs解凍源于供體雞6型品系公雞和母雞的PGC(原始生殖細(xì)胞)，培養(yǎng)幾周的時間使其增殖；5000～6000個公雞或母雞PGC注射入寄主伊莎褐雞胚胎 （階段16）的背側(cè)主動脈；這些胚胎孵化至出雛，雛雞通過PCR(多聚酶鏈反應(yīng))進(jìn)行性別鑒定；與供體雞PGC性別匹配正確的寄主雞雛雞飼養(yǎng)至性成熟（成為后1代公雞和母雞）；（后1代公雞采精給后1代母雞輸精、種蛋孵化、產(chǎn)生后2代雛雞）獲得了攜帶6型品系供體雞PGC的3只公雞和3只母雞。用微衛(wèi)星試探性分析公雞的精液，鑒定出精液中供體PGCs貢獻(xiàn)最大的公雞。1公2母（后2代攜帶6型品系供體雞PGC）與野生型伊莎褐雞（母公）交配，（后3代）數(shù)據(jù)顯示繁殖率正常，見表2。

表2 新建種群雞（含有外源PGCs）的繁殖率

運(yùn)用微衛(wèi)星分析鑒定這些（后3代）雞的基因型是否來自6型品系，源生物科學(xué)的引物MCW 145產(chǎn)生190bp等位基因的PCR反應(yīng)物（6型品系基因組DNA），鐳258產(chǎn)生265bp等位基因，鐳221要么產(chǎn)生207/208bp要么產(chǎn)生235bp等位基因（在這個位點(diǎn)上有兩個不同的等位基因）。IBL11-12母雞含有190bp等位基因，但無其它微衛(wèi)星標(biāo)記表明是6型品系的后代。IBL14-7母雞（5只小雞中有4只）含有全部的3個微衛(wèi)星標(biāo)記，表明大部分后代源于6型品系。IBL11-6公雞含有全部的3個微衛(wèi)星標(biāo)記，表明后代源于6型品系。

這些結(jié)果表明，供體雞PGCs冷凍保存后能夠產(chǎn)生活配子和后代。

3 討論

世界上70%的畜禽遺傳資源分布在發(fā)展中國家，因戰(zhàn)亂、政策、集約化生產(chǎn)、對人的健康或生命有威脅的人畜共患病、環(huán)境保護(hù)等因素，致使這些豐富的種質(zhì)資源面臨生存危機(jī)[3]。曲魯江（2004）運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記及部分品種mtDNA控制區(qū)的序列變異，對中國不同地區(qū)的78個地方雞種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)中國地方雞種具有較高的多態(tài)性，平均雜合度(H)為 0.622，多態(tài)信息含量(PIC)均值為0.573?？蓪⒅袊牡胤诫u種分為六大類型，即西北型、華南型、西南Ⅰ型、西南Ⅱ型、華東型和華中型[4]。在過去的數(shù)十年，為了加快禽業(yè)發(fā)展，多數(shù)采用集約化生產(chǎn)方式，選擇和應(yīng)用產(chǎn)蛋量高、產(chǎn)肉速度快的品種，忽視了地方品種，致使我國20%的家禽種質(zhì)資源受到不同程度的威脅[5]。在人們經(jīng)濟(jì)和生活水平日益提高的當(dāng)代，不少的消費(fèi)者喜愛“原汁原味”、有特色的地方禽種產(chǎn)品，但有些已經(jīng)不復(fù)存在。這就說明，在不喜愛某些品種的時候要保留其遺傳基因，在未來又喜愛的時候可以重新建立種群。英國對雞的原生殖細(xì)胞凍存并重建種群的研究，對我國家禽種質(zhì)資源保存有重大的啟示，應(yīng)當(dāng)盡快開展研究和應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Nandi S,Whyte J,Taylor L,et al.,Cryopreservation of specialized chicken lines using cultured primordial germ cells,Poult Sci.2016 Aug 1;95(8):1905-11.doi:10.3382/ps/pew133.

[2] MacDonald J.,Glover J.D.,Taylor L.,Sang H.M.,McGrew M.J.Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells[J].PLOS One.2010;2010;5:e15518.

[3] 王淑輝，昝林森，耿社民，等，畜禽遺傳資源保存研究進(jìn)展[J].黃牛雜志，2001，27:6.

[4] 曲魯江，中國地方雞種分子遺傳多樣性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[5] 孫莉，江蘇省畜禽遺傳資源現(xiàn)狀及保護(hù)對策研究

[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

(原文出處：Nandi S,Whyte J,Taylor L,et al.寫的 《Cryopreservation ofspecialized chicken linesusing cultured primordial germ cells》一文。 )