，，

(1．商洛學(xué)院，陜西 商洛 726000； 2．中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041)

1 引 言

納米石墨烯是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角形呈蜂巢晶格的單層片狀結(jié)構(gòu)的新材料(如圖1(A))，它是世界上最薄的新型二維納米材料，只有一個(gè)碳原子的厚度，其厚度約為0.35nm[1-2]。

石墨烯發(fā)現(xiàn)10年來，由于其具有優(yōu)異的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于復(fù)合材料、傳感器、能源等領(lǐng)域[3]。目前，有關(guān)石墨烯鋰離子電池電極材料、超級(jí)電容器、太陽能電池電極材料、儲(chǔ)氫材料、光學(xué)材料等的報(bào)道較多[3-9]。而石墨烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的研究是最近這些年才開始的，目前相關(guān)報(bào)道還比較少，但是發(fā)展十分迅速[10-13]。

圖1 石墨烯及其衍生物的分子結(jié)構(gòu) ( A)碳原子以sp2雜化軌道組成的單層結(jié)構(gòu)的石墨烯；(B)碳原子以sp2或sp3雜化軌道組成的含有羰基、環(huán)氧基和叔羥基官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的氧化石墨烯Fig.1 Graphene and its derivatives A) A graphene sheet consisting of carbon atoms of sp2 hybridization B) Graphene oxide sheet consisting of either sp2 or sp3 hybridization, due to their derivatization with carbonyls, epoxides and tertiary alcohol functional groups

目前以石墨為原料制備石墨烯的方法主要有微機(jī)械剝離法、SiC熱解外延生長法、化學(xué)氣相沉積法、化學(xué)氧化還原法等。由于制備的石墨烯化學(xué)穩(wěn)定性高，其表面呈惰性，與其他介質(zhì)的相互作用較弱，難溶于水及常用的有機(jī)溶劑。功能化是實(shí)現(xiàn)石墨烯分散、溶解和成型加工的重要手段。由于分子表面具有很多親水性官能團(tuán)，且表面積較大，功能化納米石墨烯可以被用作各種生物分子載體進(jìn)行生物檢測(cè)、藥物和基因輸送[14-19]。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較多的石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯GO[20]。因氧化條件的不同，所獲得的氧化石墨烯尺寸一般在十納米到幾百納米乃至微米之間[21]。氧化石墨烯(圖1(B))含有大量的含氧活性基團(tuán)，如羰基、羧基、羥基與環(huán)氧基等。環(huán)氧基與羥基主要位于氧化石墨烯的基面上，而羰基與羧基則通常分布在氧化石墨烯的邊緣處[22-23]。由于含有大量的含氧活性基團(tuán)，因此它具有良好的生物相容性和水溶液穩(wěn)定性，同時(shí)有利于化學(xué)功能化修飾，從而減少納米材料對(duì)生物大分子和細(xì)胞的非特異性吸附。

近年來，功能化納米石墨烯有望在生物醫(yī)學(xué)，包括生物元件、微生物檢測(cè)、疾病診斷和藥物輸運(yùn)系統(tǒng)等方面獲得應(yīng)用(圖2)[24]，使其成為納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本文將簡(jiǎn)述功能化納米石墨烯在腫瘤診斷方面的應(yīng)用及在體內(nèi)體外的行為和潛在毒性的研究進(jìn)展，并指出其現(xiàn)有研究中的不足。

圖2 石墨烯及其衍生物在生物傳感器及藥物傳遞等生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用Fig.2 Biomedical applications of graphene related materials including sensing applications, drug delivery

2 功能化納米石墨烯在腫瘤治療方面的應(yīng)用

氧化石墨烯及其衍生物應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域之前，必須對(duì)其進(jìn)行良好的表面修飾。比如還原的氧化石墨烯由于在還原過程中失去了許多含氧親水基團(tuán)，從而導(dǎo)致其在水溶液中以顆粒形式存在。雖然制備的氧化石墨烯能夠在水溶液中保持很好的穩(wěn)定性，但是GO表面帶有羧基等含氧基團(tuán)，整體帶負(fù)電荷，在生理溶液中比如PBS、生理鹽水以及細(xì)胞培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象而發(fā)生聚沉。只有通過良好的表面修飾才能提高納米氧化石墨烯材料在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性以及控制其在體內(nèi)的行為。由于氧化石墨烯邊緣和缺陷位置暴露出許多具有活性的化學(xué)基團(tuán)像羧基、環(huán)氧基和羥基等，這些基團(tuán)可以通過共價(jià)連接來使其得到修飾。在2008年，Dai和他的科研人員[25]第一次使用氨基端支鏈PEG來修飾氧化石墨烯，將其作為難溶性含芳香結(jié)構(gòu)的抗癌藥物載體，主要利用PEG的氨基和氧化石墨烯表面的羧基相連，從而獲得PEG修飾的氧化石墨烯(nGO-PEG)(10～50nm)。nGO-PEG在各種生理溶液中都顯示出非常好的穩(wěn)定性。

在2012年，劉莊課題組[26-27]使用支鏈狀PEG(C18PMH-PEG)來修飾nRGO，從而獲得具有非常穩(wěn)定的nRGO-PEG(圖3)。nRGO-PEG具有超長的血液循環(huán)時(shí)間和超高的腫瘤被動(dòng)富集，可以用于腫瘤的光熱治療，這進(jìn)一步促進(jìn)了功能化納米石墨烯在腫瘤治療中的應(yīng)用。

2.1 光熱治療(PTT)

圖3 支鏈狀PEG連接到納米石墨烯表面的示意圖Fig.3 A scheme showing the preparation of nGO-PEG, RGO-PEG, and nRGO-PEG from GO

PTT是利用光吸收物質(zhì)在激光照射下產(chǎn)生能量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞局部高溫，從而殺死腫瘤細(xì)胞。光熱治療作為一種微創(chuàng)傷的腫瘤治療手段受到廣泛的關(guān)注。光熱治療需要兩大關(guān)鍵條件：(1)是近紅外光，它具有較強(qiáng)的組織穿透能力和較低的組織吸收率。因此它能穿透深層組織，到達(dá)生物體很多部位，從而可以充分發(fā)揮治療作用。而且激光光源可以特定地照射腫瘤部位，這樣可以避開較多的正常組織進(jìn)行局部治療。這些特征為光熱治療的安全性提供了基本保證。(2)是光熱材料，它是指對(duì)近紅外光有高強(qiáng)吸收，并能將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱量釋放出來的材料。目前，很多種具有強(qiáng)近紅外吸收的納米材料包括金納米顆粒、碳納米材料甚至還有一些有機(jī)納米顆粒都可以作為光熱試劑用于腫瘤光熱治療。

然而，在臨床上，腫瘤的光熱治療有一個(gè)主要的缺陷，就是激光有限的穿透力使得在身體深處的腫瘤或者體積比較大的腫瘤無法完全治愈。除了光的穿透力以外，還需要相對(duì)高的激光功率產(chǎn)生足夠的熱能殺死腫瘤細(xì)胞。因此，如果使用超小功率達(dá)到有效的腫瘤光熱治療，就可以避免激光對(duì)正常組織的傷害。

科研工作者發(fā)現(xiàn)納米石墨烯在近紅外區(qū)(700～1100nm)有強(qiáng)的吸收。在過去的幾年里，科研人員對(duì)基于納米石墨烯的光療產(chǎn)生了濃厚的興趣。PEG修飾的GO和RGO具有很強(qiáng)的近紅外吸收，在腫瘤的光熱治療方面展現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)[25,28]。

由于nGO-PEG具有高的腫瘤被動(dòng)富集和超強(qiáng)的近紅外吸收，Liu和他的科研人員[29]以nGO-PEG作為一種光熱試劑對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行光熱治療。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有nGO-PEG處理組的腫瘤在激光照射以后1天都消失了，留下黑色燒傷的疤，一個(gè)星期以后完全脫落。在其他三組對(duì)照組中，注射生理鹽水對(duì)照組、nGO-PEG而沒有光照的組和只有光照組的小鼠腫瘤顯示出相似的快速生長，這表明光照和nGO-PEG都不影響腫瘤的生長。這一結(jié)果證實(shí)了nGO-PEG作為光熱試劑得到了極為高效的腫瘤消除(圖4)。

在2010年，Liu等[29]第一次研究了使用PEG包被熒光標(biāo)簽的納米石墨烯片(NGS)在體內(nèi)的作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相比于碳納米管，PEG功能化的NGS展現(xiàn)了一些有趣的體內(nèi)表征現(xiàn)象，包括高效率腫瘤被動(dòng)靶向識(shí)別以及在材料網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中相對(duì)較低殘留。通過利用體內(nèi)光熱療法中NGS在NIR光區(qū)的高光吸收，在靜脈注射NGS并在腫瘤移植部位用2W/cm2的808nm的近紅外激光照射腫瘤5min，經(jīng)nGO-PEG處理的小鼠表面溫度升高到50℃，而對(duì)照組小鼠腫瘤表面只升高了2℃。而且所有在接下來40天的培養(yǎng)時(shí)間里，nGO-PEG和光處理的小鼠沒有再長出腫瘤。

圖4 通過注射nGO-PEG作為光熱試劑得到活體腫瘤的光熱實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.4 Representative photoes of tumors on mice after various treatments indicated in vivo photothermal therapy study using intravenously injected nGo-PEG

最近，Dai課題組[30]發(fā)現(xiàn)將nGO-PEG還原可以得到一種超小尺寸的RGO，再用磷脂PEG修飾得到水溶性nRGO-PEG，它在近紅外區(qū)的光吸收明顯比nGO-PEG高很多，然后將多肽RGD連接到nRGO-PEG上獲得nRGO-PEG-RGD復(fù)合物，可以作為一種具有靶向性的光熱試劑進(jìn)行選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞。

2.2 光動(dòng)力治療(PDT)

與光熱治療不同，光動(dòng)力治療依賴光敏分子在適當(dāng)光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧來殺死腫瘤細(xì)胞[31]。基于納米石墨烯的光動(dòng)力治療工作是由Shi課題組首先開發(fā)的[32]。他們將光敏分子ZnPc通過π-π堆積和疏水作用力連接到nGO-PEG表面。然而，獲得的nGO-PEG-ZnPc在氙燈照射下顯示出顯著的細(xì)胞毒性。Huang et al.[33]將Ce6連接到接有葉酸的GO上實(shí)現(xiàn)葉酸受體靶向輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，然后使用633nmHe-Ne激光照射達(dá)到有效的腫瘤細(xì)胞光動(dòng)力治療。除此之外，Hu等[34]還發(fā)現(xiàn)GO-TiO2復(fù)合物在可見光照射下可實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力活性，這種光動(dòng)力活性會(huì)顯著降低線粒體膜電位，激活超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及增加丙二醛的量，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.3 基于納米石墨烯的聯(lián)合治療

基于功能化納米石墨烯腫瘤治療的多功能性，可以進(jìn)行腫瘤的聯(lián)合治療。通過π-π堆積作用，Liu課題組[35]將光敏分子Ce6裝載到nGO-PEG表面，形成nGO-PEG-Ce6復(fù)合物。在激光照射下，nGO-PEG-Ce6復(fù)合物可以產(chǎn)生單線態(tài)氧用于腫瘤光動(dòng)力治療。同時(shí)，研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的Ce6相比，nGO-PEG-Ce6能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷效率。這可能是由于nGO-PEG在近紅外的強(qiáng)吸收性質(zhì)，在nGO-PEG的幫助下，增加細(xì)胞膜的通透性，從而顯著促進(jìn)細(xì)胞吞噬nGO-PEG-Ce6的量。通過光熱和光動(dòng)力兩種手段的協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療效果(圖5)。

nGO-PEG的光熱治療效果也可以與化療結(jié)合在一起實(shí)現(xiàn)聯(lián)合治療。Zhang et. al.將DOX裝載到nGO-PEG表面進(jìn)行化療，然后利用nGO-PEG的近紅外吸收，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的光熱治療-化療的協(xié)同效應(yīng)[26]。與單獨(dú)的熱療或者化療相比，這種化療-熱療的聯(lián)合治療在小鼠腫瘤上實(shí)現(xiàn)了很高的治愈率(圖6)。

3 納米石墨烯的生物安全性

納米材料的安全性對(duì)于他們?cè)谏镝t(yī)學(xué)上的應(yīng)用是至關(guān)重要的。納米石墨烯和許多無機(jī)納米材料一樣，都不容易被降解。因此，納米石墨烯在生物體中的行為以及潛在的毒性，是需要解決的重中之重。

Zhang et al.[36]比較了不同類型的碳納米材料包括納米金剛石、碳納米管及GO對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性。研究結(jié)果顯示，GO相對(duì)于其它兩種材料顯示出最低的細(xì)胞吞噬率，但是三種材料對(duì)細(xì)胞都顯示出同樣的濃度依賴性毒性。Lu等也對(duì)納米石墨烯的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NGO濃度達(dá)到100mg/L時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)存活率仍接近100%，這說明NGO對(duì)細(xì)胞毒性較低。Zhang課題組研究發(fā)現(xiàn)，葉酸修飾的NGO在濃度高達(dá)100μg/mL時(shí)，仍沒有明顯的細(xì)胞毒性[37]。Peng等[38]研究了氧化石墨烯復(fù)合物用于熒光探針進(jìn)行細(xì)胞成像的生物安全性，結(jié)果表明該復(fù)合材料未表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，濃度為40μg/mL時(shí)僅使細(xì)胞的新陳代謝活性略有下降，而且這種中毒細(xì)胞的毒作用是可以逆轉(zhuǎn)的，其代謝活性可以恢復(fù)。

Liao et al.等[39]也發(fā)現(xiàn)小尺寸的GO能夠顯著引起溶血，但是如果用殼聚糖修飾GO將會(huì)完全消除溶血現(xiàn)象。納米石墨烯和沒有表面修飾的GO對(duì)各類型細(xì)胞的毒性是濃度依賴性的。相反，GO經(jīng)過適當(dāng)?shù)挠H水大分子修飾如殼聚糖[40]、PEG、葡聚糖[41]和一些蛋白質(zhì)修飾以后顯著地降低了GO的細(xì)胞毒性。Hu et.al.[42]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中FBS也能降低GO的毒性。GO可以通過靜電和疏水作用力吸附蛋白，從而阻礙GO與細(xì)胞直接接觸，進(jìn)而減小對(duì)細(xì)胞的毒性。Liu課題組[43]還進(jìn)一步研究了功能化納米石墨烯在體內(nèi)的長期分布和長期毒性，發(fā)現(xiàn)使用生物相容性高分子如PEG修飾GO，通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，放射性核素標(biāo)記的PEG修飾的納米石墨烯主要聚集在肝脾部位，但是可以通過尿液和糞便慢慢排出體外。通過對(duì)處理組小鼠的血常規(guī)和血生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在90天的時(shí)間里，PEG修飾的納米石墨烯在20mg/kg的劑量下并沒有對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的肝功能和腎功能造成明顯的毒性傷害。

圖5 光熱促進(jìn)光動(dòng)力治療示意圖。(a)光熱促進(jìn)光動(dòng)力治療示意圖；(b～d):KB細(xì)胞與nGO-PEG-Ce6在37℃培養(yǎng)后沒有808nm激光照射(b)或有808nm激光照射(c)以及細(xì)胞在43℃的激光共聚焦照片(d)；(e)在Ce6濃度為2.5μm下，細(xì)胞在不同條件下吞噬nGO-PEG-Ce6的量；(f)KB細(xì)胞在Ce6濃度為2.5μm下與nGO-PEG-Ce6，Ce6和nGo-PEG培養(yǎng)下的相對(duì)細(xì)胞活度Fig.5 Photothermally enhanced photodynamic therapy. Ce6 loaded nGO-PEG(nGO-PEG-Ce6) was used in this study. (a)A scheme of photothermally enhanced photodynamic therapy. (b-d)Confocal fluorescent images of KB cells incubated with nGO-PEG-Ce6 at 37℃ without (b) or with 808nm laser irradiation(c), and cells incubated at 43℃(d). (e)Cell uptake of nGO-PEG-Ce6 in different treatment groups at the Ce6 concentration of 2.5μm. The concentration of Ce6 was determined by the measured fluorescence intensities of cell lysate samples. (f)Relative viabilities of KB cells treated with nGO-PEG-Ce6, Ce6 and nGO-PEG at Ce6 concentration of 2.5μm

圖6 使用nGO-PEG進(jìn)行的熱療和化療的聯(lián)合治療。(a)不同處理組小鼠腫瘤的生長曲線。在DOX和nGO-PEG/DOX處理組的DOX濃度為10mg/kg，激光功率為2W/cm2，照射時(shí)間為5min；(b)各個(gè)處理組小鼠的體重變化曲線，沒有觀察到明顯的體重下降；(c)不同處理組代表小鼠的照片F(xiàn)ig.6 Combined photothermal therapy and chemotherapy using nGO-PEG. (a)Tumor growth curves of different groups of mice after various treatments indicated. The drug dose in free DOX and nGO-PEG/DOX groups was 10mg/kg in terms of DOX. The laser irradiation was applied at the power density of 2W/cm2 for 5min. (b)Body weights of mice in different treated groups. No obviously weight loss was observed. (c)Photos of mice after different treatments indicated. Tumors of mice treated with NGO-PEG/DOX+NIR laser were completely ablated after 30 days

4 總結(jié)與展望

通過良好的表面修飾來提高納米石墨烯材料在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性和相容性以及控制在體內(nèi)的行為，使得功能化納米石墨烯應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域成為可能。目前，功能化納米石墨烯在腫瘤治療方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但大多處于起步階段，還不夠深入、系統(tǒng)。總之，尚需要在分子、細(xì)胞及器官乃至整個(gè)生物體層次上，深入研究納米石墨烯及其衍生物與生物體系的相互作用機(jī)制，為納米石墨烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

目前制備的納米石墨烯在尺寸上分布比較寬(從10nm～50nm不等)，這間接地影響了納米石墨烯的尺寸效應(yīng)在生物體內(nèi)的行為；現(xiàn)在，大多數(shù)研究都采用PEG來修飾納米石墨烯，從而獲得生物相容性較好的功能化納米石墨烯，并將其應(yīng)用于腫瘤治療，這也需要進(jìn)一步開發(fā)出更多更好的表面修飾高分子，以便提高在腫瘤部位的富集量。雖然科研人員已經(jīng)從器官的組織學(xué)及血液學(xué)上宏觀地探究了功能化納米石墨烯在體內(nèi)的長期分布和長期毒性，但尚未從分子水平上研究功能化納米石墨烯對(duì)基因調(diào)控和蛋白表達(dá)的影響?？蒲腥藛T對(duì)這種新型的碳納米材料還需作出更多的長期研究。

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