孫杰 ，桑凱 ，王東曉 ，張旭輝 ，馬泉 ，柳志清

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可以預(yù)防和治療的疾病，與氣道和肺組織對煙草煙霧等有害氣體或有害顆粒的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，其特征是持續(xù)存在呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究項目組估計，2020年COPD將位居全球死亡原因的第3位[1]。生長激素釋放肽(Ghrelin)與肥胖抑制素(Obestatin)是新近發(fā)現(xiàn)的腦腸肽，是由胃分泌的重要食欲和能量調(diào)節(jié)肽，參與機(jī)體代謝調(diào)節(jié)[2]。研究顯示 Ghrelin、Obestatin與COPD合并營養(yǎng)不良關(guān)系密切[3～4]，其與系統(tǒng)炎癥及細(xì)胞因子之間相互作用參與COPD合并營養(yǎng)不良的發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)培土生金法配合常規(guī)西藥治療可進(jìn)一步提高肺脾氣虛型COPD患者的中醫(yī)證候療效及降低生活質(zhì)量評分，改善患者肺功能及營養(yǎng)狀態(tài)[5]，但其作用機(jī)制尚未闡明。本實驗參照文獻(xiàn)[6～7]制作肺脾兩虛型COPD大鼠模型，用ELISA法檢測參苓白術(shù)散不同時間干預(yù)下對肺脾兩虛型COPD模型大鼠血清Ghrelin、Obestatin、瘦素及炎癥因子的含量變化，觀察培土生金法防治COPD的時空效應(yīng)，并進(jìn)一步探討其對COPD的防治機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證編號SCXK(甘)2015-0002，動物實驗設(shè)施使用證編號：SYXK(甘)2015-0005，實驗動物生產(chǎn)批號：No.62001000000270。動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗室，環(huán)境溫度(23±3)℃，相對濕度30%～40%。

1.2 主要試劑與儀器 脂多糖(美國Sigma公司)；蘭州牌香煙(甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量14 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)；血清Ghrelin檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；血清Obestatin檢測試劑盒、血清瘦素檢測試劑盒、血清TNF-α檢測試劑盒、血清IL-1檢測試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司，型號：iMark 1509)；Hallowell EMC氣管插管工具盒(美國Braintree Scientific公司)；HCT氣溶膠煙霧染毒系統(tǒng)(美國CH Technologies公司，型號：GYD-CHT)；生物信號采集系統(tǒng)(法國EMKA公司)。

1.3 實驗藥物 番瀉葉浸液：番瀉葉購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診中藥房，浸泡12 h，絞汁過濾，裝入燒杯，置于40℃恒溫水浴箱，濃縮至含生藥1 g/mL，4℃冰箱保存。參苓白術(shù)散(人參、茯苓、白術(shù)、山藥、甘草各20 g，蓮子、砂仁、薏苡仁、桔梗各12 g，白扁豆15 g)，按原方比例配伍組成，實驗選用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的免煎顆粒劑(批號：0503014)。

1.4 分組及造模 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、藥物干預(yù)組(根據(jù)藥物干預(yù)時間不同，分為參苓白術(shù)散28天、35天、42天組)，每組12只。參照宋一平等[6～7]動物模型復(fù)制法建立肺脾兩虛型COPD大鼠模型。第1天、14天，經(jīng)口、氣管滴注脂多糖(LPS)，將麻醉后大鼠四肢、頭部呈仰臥位固定于鼠板，將大鼠上門齒向后牽拉固定，使氣管伸直，暴露口腔，將喉鏡插入大鼠口腔，于吸氣相迅速將氣管插管插入氣道。在1 mL針管內(nèi)先抽入相應(yīng)量溶于生理鹽水的LPS(1 mg/mL)，于大鼠吸氣瞬間迅速推注LPS(大鼠用量1 mg/kg)。再向氣管內(nèi)迅速推注0.5 mL氣體1～2次以使LPS充分分布于肺組織內(nèi)。拔出針管，輕拍大鼠胸背部，并輕輕抖動，使藥物均勻分布于肺內(nèi)。第2～28天、35天、42天，每天上午將大鼠放于氣溶膠染毒系統(tǒng)內(nèi)煙熏30 min，2次(滴注LPS當(dāng)天不煙熏，空白組呼吸空氣)。自造模第7天起在熏煙前0.5 h給予濃度1 g/mL冰冷番瀉葉浸液，按10 mL/kg劑量，連續(xù)灌胃至28天、35天、42天。參苓白術(shù)散與番瀉葉灌胃時間間隔＞4 h，為避免藥物間藥效相干擾，時間間隔應(yīng)超過大鼠胃排空時間。

1.5 干預(yù)方法 實驗藥物用量按體表面積比率換算，參苓白術(shù)散大鼠用量為14.67 g/(kg·d)，空白組及模型組給予等容量生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)灌胃干預(yù)至28天、35天、42天。

1.6 標(biāo)本采集與處理 實驗過程中觀察大鼠活動度、毛發(fā)光澤、體質(zhì)量、攝食量、呼吸、咳喘、大便等情況。分別于第28天、35天、42天對相應(yīng)組大鼠麻醉后取血。打開腹腔，暴露腹主動脈，經(jīng)腹主動脈采血4～6 mL，20℃、3 000 r/min，離心15 min，制備血清，分裝于EP管中，待做ELISA檢測。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 指標(biāo)檢測 觀察各組大鼠一般狀態(tài)(皮毛光澤度、飲食情況、體質(zhì)量變化、活動度、精神狀態(tài)、糞便)及大鼠氣管和呼吸道分泌物等情況。取大鼠左肺及胃組織在常規(guī)多聚甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。分別于實驗第28天、35天、42天對各組大鼠進(jìn)行肺功能測定。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，將麻醉后大鼠固定于鼠板上，用大鼠喉鏡經(jīng)口-氣管插管法，插入氣管插管并固定置于體描箱中，將插管一端連接生物信號采集系統(tǒng)傳感器，與之配套的計算機(jī)軟件相應(yīng)功能區(qū)自動描記呼吸曲線，測定大鼠呼吸頻率F(每只觀測3 min，F(xiàn)取其平均值)、肺容量指標(biāo)TV、流量指標(biāo)EF50、肺動態(tài)順應(yīng)性Cdyn。采用ELISA法檢測大鼠血清中Ghrelin、Obestatin、瘦素、IL-1、TNF-α的含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用Dunnett法，進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 見表1。在造模過程中模型組、參苓白術(shù)散42天組大鼠各死亡2只，參苓白術(shù)散28天組、參苓白術(shù)散35天組大鼠各死亡1只?？瞻捉M大鼠發(fā)育良好，反應(yīng)靈敏，精神狀況好，皮毛亮澤，納食正常，體質(zhì)量漸增；模型組大鼠形體消瘦，皮毛枯槁無澤或有脫落、可見豎毛，精神不振，反應(yīng)遲鈍，少食，扎堆蜷縮拱背，呼吸急促，咳嗽，偶可聞及氣道痰鳴音，口鼻分泌物增多，體質(zhì)量明顯下降，腹瀉便溏，糞質(zhì)稀薄。與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠癥狀不同程度減輕，精神狀況較好，皮毛欠潤澤，口鼻分泌物減少，活動尚靈活，攝食量尚可，呼吸稍平穩(wěn)，偶有咳喘。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，參苓白術(shù)散35天組和參苓白術(shù)散42天組大鼠體質(zhì)量均有升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)觀察(×200)

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較(x±s) g

2.2 各組大鼠肺、胃組織病理形態(tài)學(xué)改變 見圖1，見圖2?？瞻捉M大鼠支氣管管壁及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔及支氣管腔內(nèi)無滲出物，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺組織支氣管壁及附近炎性細(xì)胞廣泛浸潤，氣管壁結(jié)構(gòu)損傷，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂或斷裂融合成大氣腔。與模型組比較，參苓白術(shù)散28天組大鼠支氣管黏膜充血、水腫情況較輕，炎性浸潤改善，肺泡腔擴(kuò)張和肺泡壁斷裂、融合的范圍和程度均較輕，其病理狀況改善明顯；參苓白術(shù)散35天組大鼠肺間質(zhì)炎性浸潤明顯減輕，杯狀細(xì)胞較少見；參苓白術(shù)散42天組大鼠肺間質(zhì)炎性浸潤顯著改善，管壁增厚減輕，肺泡數(shù)目增加，結(jié)構(gòu)相對完整，提示經(jīng)藥物干預(yù)可顯著減輕大鼠肺組織病理改變程度，延緩COPD病程?？瞻捉M大鼠胃黏膜層結(jié)構(gòu)完整，模型組大鼠出現(xiàn)黏膜充血與水腫，固有層與黏膜下層可見炎性細(xì)胞浸潤，各藥物干預(yù)組可見胃黏膜充血水腫不同程度減輕，炎性浸潤改善明顯。

圖2 各組大鼠胃組織病理形態(tài)觀察(×400)

2.3 各組大鼠肺功能比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠呼吸頻率F升高，TV、EF50、Cdyn均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，參苓白術(shù)散28天、35天、42天組大鼠呼吸頻率F下降，TV、EF50、Cdyn不同程度升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與參苓白術(shù)散28天組比較，參苓白術(shù)散42天組大鼠F值下降，Cdyn升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠肺功能比較(x±s)

2.4 各組大鼠血清Obestatin、Ghrelin、瘦素含量比較 見表3。與空白組比較，模型組大鼠血清中Obestatin、Ghrelin含量明顯減少，瘦素含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，參苓白術(shù)散28天、35天、42天組大鼠血清中Obestatin、Ghrelin含量不同程度升高，瘦素含量不同程度下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與參苓白術(shù)散28天組比較，參苓白術(shù)散42天組Obestatin含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清Obestatin、Ghrelin、瘦素含量比較(x±s)pg/mL

2.5 各組大鼠血清IL-1、TNF-α含量比較 見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，參苓白術(shù)散28天、35天、42天組大鼠血清TNF-α、IL-1含量均有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與參苓白術(shù)散28天組比較，參苓白術(shù)散42天組大鼠TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組大鼠血清IL-1、TNF-α含量比較(x±s) pg/mL

3 討論

Ghrelin是一種新型的腦腸肽，主要由胃底部黏膜處泌酸腺細(xì)胞X/A合成并分泌，為生長激素促分泌物受體(GHSR)的內(nèi)源性配體。它在人體的胃、十二指腸、結(jié)腸和大腦皮層都有表達(dá)，且部分產(chǎn)生于下丘腦弓狀核、垂體、腎臟、胎盤等組織[8]，其在下丘腦和胃底部的表達(dá)量最多[9]。Ghrelin是一種胃源性促食激素，分泌到血液中，通過激活下丘腦亞科核中的NPY/AgRP神經(jīng)元啟動攝入食物，可以起到刺激飲食、增加體質(zhì)量、維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的作用[10]。Obestatin是一種多效肽，其通過抑制胃腸道的運動，調(diào)節(jié)胰島素的分泌，減少炎癥和凋亡以及促進(jìn)增殖，對Ghrelin起拮抗作用[11]，廣泛分布于大腸、小腸、胃、脾和大腦皮層[12]，其中胃組織含量最高。瘦素作為脂肪組織分泌的最相關(guān)的因子，具有調(diào)節(jié)食欲和食物攝取、基礎(chǔ)代謝、生殖功能和胰島素分泌等功能[13]，研究顯示瘦素的高水平表達(dá)可抑制Ghrelin釋放[14]。本實驗中模型組大鼠血清中Ghrelin表達(dá)下降，或許是由兩方面造成的，一方面，胃黏膜充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤，使得Ghrelin分泌不足；另一方面，COPD本身存在的全身炎癥反應(yīng)及高瘦素水平抑制了Ghrelin的表達(dá)，而Obestatin作為其拮抗肽，也相應(yīng)減少。

中醫(yī)學(xué)中并沒有COPD的病名，但從其臨床表現(xiàn)及病變過程來看，屬于中醫(yī)咳嗽、喘證及肺脹等范疇。筆者認(rèn)為以培土生金法治療COPD具有堅實的中醫(yī)藏象理論和臟腑病機(jī)理論依據(jù)。治療過程中見肺之病先實脾，脾氣健，則宗氣生化有源。參苓白術(shù)散是體現(xiàn)“培土生金”治法的代表方，方中以四君子湯為基礎(chǔ)，用人參大補(bǔ)元氣，補(bǔ)肺益脾；白術(shù)補(bǔ)氣健脾；山藥益氣養(yǎng)陰，肺脾腎同補(bǔ)；茯苓、扁豆、蓮肉補(bǔ)脾滲濕；砂仁醒脾；桔梗升清，宣肺利氣。綜觀全方，補(bǔ)肺氣，健脾氣，培土生金，兼以滲濕濁，行氣滯。筆者臨床觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期COPD營養(yǎng)不良患者多表現(xiàn)為咳嗽、喘息、氣短等肺氣虛證候，兼有神疲食少、胃脘痞滿、便溏納呆等脾虛證候，中醫(yī)辨證屬肺脾兩虛證，故以此方治療COPD，契合病機(jī)。本實驗顯示在參苓白術(shù)散的干預(yù)下，COPD大鼠體質(zhì)量增加明顯，肺功能改善，肺組織及胃組織病理變化減輕，并且隨著干預(yù)時間的增加，其癥狀改善明顯；同時，干預(yù)組大鼠血清瘦素明顯下降，炎癥因子IL-1、TNF-α含量減少，這提示在胃組織病理變化改善的基礎(chǔ)上，參苓白術(shù)散可抑制血清瘦素的表達(dá)，從而使Ghrelin及Obestatin含量增加，從這點解釋，培土生金法可改善模型組大鼠一般狀況及營養(yǎng)狀況，很有可能是通過調(diào)節(jié)血清中Ghrelin及Obestatin水平，保持能量平衡而實現(xiàn)的。其調(diào)節(jié)Ghrelin及Obestatin的機(jī)制，則是胃黏膜的修復(fù)及血清中瘦素與炎癥因子的降低。同時，本實驗結(jié)果顯示，在各藥物干預(yù)組中，隨著時間的增加，COPD大鼠的癥狀改善越明顯，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這表明培土生金法的早期應(yīng)用對COPD大鼠有保護(hù)作用，并且在COPD發(fā)生后的發(fā)展過程中也能起到重要作用，進(jìn)一步提示了培土生金法對COPD的防治作用。

綜上所述，培土生金法代表方參苓白術(shù)散可增加肺脾兩虛型COPD模型大鼠體質(zhì)量，改善其肺功能，減輕肺組織病理損傷，改善其營養(yǎng)狀態(tài)，機(jī)制可能是上調(diào)肺脾兩虛型COPD大鼠血清Ghrelin、Obestatin的表達(dá)及下調(diào)血清中瘦素及炎癥因子的表達(dá)。

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