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0 引言

拉曼光譜是一種基于分子極化率變化的分子振動光譜，具有無損、高靈敏度、高分辨力，可在線檢測等優(yōu)點。近年來，隨著納米材料與生物醫(yī)學的不斷發(fā)展，拉曼光譜越來越多地被應用到生物醫(yī)學研究領域[1]。JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及2016年《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見稿中雖提出了液體和固體樣品檢測的指導意見，但對于生物樣品如細胞及組織切片等復雜樣品的檢測未能給出檢測標準或指導意見。隨著當前拉曼光譜對生物樣品（如細胞和組織切片等樣品）的研究不斷增多，由于該類樣品自身信號微弱，研究者發(fā)現(xiàn)承載生物樣品的基底材料的信號在所采集到的樣品的拉曼散射信號中有了明顯的貢獻，從而會對生物樣品的拉曼光譜檢測結果產生明顯干擾。同時，傳統(tǒng)拉曼光譜的檢測在選擇基底時是選擇無明顯拉曼散射信號或信號微弱的材料作為基底，如玻璃（信號微弱）或氟化鈣（600 cm-1以后無拉曼散射信號），但隨著拉曼光譜材料科學（如表面增強拉曼光譜）的發(fā)展與拉曼光譜在生物醫(yī)學領域應用的不斷拓展，研究者發(fā)現(xiàn)某些基底材料雖然沒有明顯拉曼光譜的信號，但在某些情況下基底材料仍然貢獻了不可忽略乃至很強的背景信號。同時，隨著近年來表面增加拉曼光譜（SERS）技術及微納米加工技術的不斷進步與發(fā)展，已有多種商品化的具備拉曼光譜增強效果的SERS活性基底芯片可供科研人員選擇。然而，這些基底由于價格昂貴、易氧化且不可重復利用等原因，尚未能大規(guī)模被科研人員利用在生物樣品的檢測領域。同時，這些芯片材料主要是以光滑的硅片或二氧化硅玻璃為支撐基底，在其表面修飾具有拉曼光譜增強能力的金、銀的納米結構，從而制備出具備SERS增強效果的固體基底。然而這些活性基底材料的支撐基底仍多為二氧化硅，故在實際樣品檢測過程中也有可能需要考慮二氧化硅等的背景信號的影響。綜上所述，研究不同基底材料在不同的檢測條件下的背景信號，并研究這些信號與基底材料的拉曼光譜信號之間的關聯(lián)性，進而明確基底的選擇標準具有現(xiàn)實意義。本文通過研究六種較為常見的不同基底材料的拉曼光譜以及發(fā)射光譜，確定了這些材料在不同拉曼光譜檢測條件下的適用性，并通過總結，提出了拉曼光譜基底材料的選擇條件。

1 測量系統(tǒng)的構成

生物樣品的拉曼光譜檢測系統(tǒng)由拉曼光譜的顯微系統(tǒng)（物鏡）和承載有生物樣品的基底構成，如圖1所示，整個系統(tǒng)置于減震平臺上，基底置于顯微物鏡下。若生物樣品為活體或含水檢測，需定時在基底上添加相應的緩沖液。將基底放置于顯微物鏡下，通過物鏡的觀察，調節(jié)物鏡臺將物鏡聚焦樣品表面。通過拉曼光譜儀控制軟件，設定激光波長、檢測范圍和掃描時間等參數，并控制拉曼光譜信號的采集。圖2和圖3分別為顯微鏡視野下的癌細胞與病理組織切片。

圖1 顯微拉曼光譜儀顯微系統(tǒng)與細胞培養(yǎng)皿

圖2 顯微鏡視野下的癌細胞

圖3 顯微鏡視野下的病理組織切片

本文所用拉曼光譜儀為Horiba Jobin Yvon公司的XploRA型激光顯微拉曼光譜儀，激發(fā)光波長可選532 nm和785 nm，拉曼光譜測試范圍設定為200～4 000 cm-1，散射光譜測試范圍設定為535～1 000 nm，信號采集方式為180°背散射檢測，掃描時間為1 s平均10次，或者30 s。

2 方法依據與方法分析

由于拉曼光譜及拉曼光譜儀在檢測過程中具有不損傷樣品，不受樣品中水分的影響，較高的空間分辨力，以及提供檢測對象豐富的結構信息等特點[2][3]，同時隨著近年來納米材料的發(fā)展，特別是表面增強拉曼光譜標記技術的發(fā)展[4]，拉曼光譜越來越多地被運用到生物樣品（如細胞、組織切片等樣品）的分析與研究中。在進行拉曼光譜樣品檢測時，需將樣品放置于基底如載玻片上，再放置于顯微鏡下進行檢測。常規(guī)樣品由于密度較高且厚度足夠厚可確保激發(fā)光無法穿透樣品，因而在通常情況下無需考慮承載樣品的基底信號。但在檢測生物樣品時，情況卻有所不同。一方面，因為生物樣品通常厚度很薄（細胞厚度在數十微米，超薄組織切片厚度為數十微米至數百微米）且密度較低（主要成分為水），檢測時激發(fā)光已可穿透樣品并照射至承載基底；另一方面，隨著SERS標記技術[5]的發(fā)展，越來越多的用于標記細胞及組織表面特定位點的SERS標記物的工作激光被優(yōu)化為波長較長的激光（如波長為633 nm和785 nm的激光），所以，面對生物樣品時，必須考慮基底材料自身的信號，尤其是特定波長下的基底信號，以明確基底背景信號的干擾。

由于在沒有熒光干擾、共振和增強的情況下，拉曼光譜的散射峰位置及比例關系與激發(fā)光波長無關[6]，故通常情況下拉曼光譜儀的激發(fā)光選取任意波長的激光即可，而常規(guī)基底選用幾乎沒有強拉曼散射信號的鈉鈣玻璃載玻片。鈉鈣玻璃載玻片的拉曼光譜信號如圖4（1）所示，其自身拉曼光譜信號譜峰范圍有限且信號強度微弱，幾乎不用考慮其信號作為背景信號的干擾。然而，隨著近年來納米技術及在生物領域內應用的不斷拓展，單一激發(fā)光特別是短波長的激光已經無法滿足這些領域的需求。當使用能夠滿足上述應用領域的激光如638 nm或785 nm等較長波長激光做激發(fā)光時，尤其是用785 nm的激光檢測載玻片的時候，發(fā)現(xiàn)載玻片的非拉曼信號，如硅鈣玻璃結構中的氧空穴發(fā)光，見圖4（2），已經成為無法忽略的背景信號，甚至可能對樣品的定性及定量檢測結果造成干擾?；谏鲜霈F(xiàn)象，本文考察并分析了包括載玻片在內的六種基底的拉曼信號與其他光致發(fā)光信號，指出這些材料作為基底的適用范圍及基底的選擇方法，進而對JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及2016年《激光拉曼光譜分析方法通則》提出補充，以期促進拉曼光譜的標準化使用。

2.1 測量步驟

1）將基底材料放置于拉曼光譜儀的樣品臺上；

2）調節(jié)樣品臺位置，將待檢測物置于物鏡下；

3）調節(jié)樣品臺高度，使視野內的待檢測物邊界清晰，即使待檢測物置于物鏡焦點；

圖4 532 nm（1）和785 nm（2）波長激光激發(fā)下測得的載玻片拉曼光譜圖

4）在拉曼光譜儀中設定好檢測范圍、掃描時間和激光波長等參數，開始檢測，獲取拉曼散射信號和發(fā)光信號。

2.2 基底材料拉曼光譜信號的影響

目前最常用的基底材料是以硅鈣玻璃為原料的載玻片和以聚丙烯為原料的培養(yǎng)皿，分別用來承載組織切片和細胞樣品。一方面由于對透光性能的要求不斷提升，另一方面隨著近年拉曼光譜在生物領域越來越廣泛的運用，越來越多的材料被用作生物材料承載基底。本文選取了六種材料（如圖5），分別為載玻片、培養(yǎng)皿、藍寶石玻璃、石英玻璃、氟化鈣片和氟化鋇片，將這六種材料置于拉曼光譜儀下，用波長為532 nm的激光，按2.1的步驟檢測它們的拉曼光譜信號，檢測結果如圖6所示。從圖6中可以看到，在532 nm下，載玻片、氟化鈣和氟化鋇在400 cm-1后均沒有明顯的拉曼信號，石英玻璃至800 cm-1后才無明顯信號，而培養(yǎng)皿和藍寶石玻璃有明顯的信號。上述結果表明載玻片、氟化鈣和氟化鋇具有低拉曼光譜信號的特點。

圖5 不同材質的基底材料（1-氟化鈣；2-氟化鋇；3-藍寶石；4-石英；5-載玻片；6-培養(yǎng)皿）

圖6 激發(fā)光為532 nm下采集的不同材質基底的拉曼光譜

2.3 基底材料的發(fā)光信號的影響

當把激光調整至785 nm后，重新對上述六種基底材料進行檢測，結果如圖7所示。從圖7中發(fā)現(xiàn)，藍寶石、培養(yǎng)皿和石英玻璃依舊有明顯的背景干擾，且出峰位置與532 nm激光激發(fā)出的譜峰位置一致，說明該信號確為拉曼散射信號。同時氟化鋇依然保持與532 nm激光條件下相同的結果，均無明顯的拉曼散射信號。但觀察載玻片和氟化鈣的信號時，發(fā)現(xiàn)這兩種材料的信號與532 nm激光激發(fā)的信號有明顯差別，說明785 nm下出現(xiàn)的信號不是拉曼散射信號。為了進一步驗證這個假設，將激發(fā)光重新調整至532 nm，檢測范圍設置為534～1 000 nm，用于檢測材料的發(fā)光光譜。圖8是上述六種材料的發(fā)射光譜，其中藍寶石基底自600～1 000 nm有巨大的發(fā)光峰，該發(fā)光峰為藍寶石的本征發(fā)射峰；載玻片于880 nm處有明顯的發(fā)射信號，該信號為氧空穴的發(fā)射峰，經過式（1）的計算

式中：Raman shift—— 拉曼散射光，波數；

λ1—— 激發(fā)光波長，nm；

λ2—— 散射光波長，nm

發(fā)現(xiàn)與785 nm激光檢測的拉曼光譜在1 380 cm-1處的峰一致；氟化鈣于862 nm、869 nm、877 nm和921 nm有兩組非常尖銳的發(fā)射信號，信號為氟化鈣的本征發(fā)射信號，同樣經過式（1）的計算，同樣與785 nm激光激發(fā)的拉曼光譜的1 141 cm-1、1 237 cm-1、1 348 cm-1和1 875 cm-1處的峰一致；培養(yǎng)皿在激發(fā)光的波長附近有尖銳的信號，其為聚丙烯的拉曼散射信號；石英玻璃除了在534～580 nm之間有拉曼散射外，只有在700 nm和880 nm附近有兩個較弱且較寬的發(fā)光信號；而氟化鋇在整個檢測范圍內，除激發(fā)光波長附近（236 cm-1）有一個明顯的尖銳信號外，再無其他明顯信號。從上述結果可以看到，藍寶石、玻璃與氟化鈣的發(fā)光信號已經影響到長波長激光（785 nm）作激發(fā)光下的拉曼光譜信號，而785 nm或更長波長的激發(fā)光是拉曼光譜用于生物檢測首選，說明藍寶石、玻璃、石英與氟化鈣的發(fā)射光譜會對生物樣品拉曼光譜的檢測結果有不同程度的干擾。而氟化鋇因其在540～1 000 nm的范圍沒有任何發(fā)射光譜，使其成為一種優(yōu)良的生物樣品拉曼光譜檢測承載基底。

圖7 激發(fā)光為785 nm下不同材質基底的拉曼光譜

圖8 不同材質基底的發(fā)光光譜

最后，為了驗證上述六種基底用作生物樣品承載基底的背景影響，癌細胞分別被分散及固定在這幾種基底的表面，并使用相同條件對癌細胞進行檢測，結果如圖9所示，其中癌細胞的數據是由承載于載玻片上的細胞數據扣除載玻片背景基底數據所得到的。從圖9中可以看出，因為細胞含水量高且密度低，故其信號極微弱，所以處于不同承載基底上的細胞信號均是承載基底本身的信號，同時從結果中也可以看出，在關鍵的400～1 800 cm-1的生物樣品信號區(qū)，氟化鋇承載基底上的背景信號確實影響最小，從而證明氟化鋇在這六種承載基底中是最優(yōu)良的生物樣品承載基底。

3 基底選擇方法

通過上述分析，發(fā)現(xiàn)這六種材料中，氟化鋇是最好的承載材料，具有拉曼信號干擾范圍小，無明顯發(fā)射光譜等優(yōu)點，最適用于作為生物樣品的承載。從分析的過程中，可以探究承載基底的選擇標準：1）承載基底材料的拉曼散射信號微弱或信號范圍?。?）承載基底材料的發(fā)射光譜在被拉曼光譜檢測范圍內無明顯發(fā)光信號。

圖9 扣除背景的癌細胞及不同基底上的癌細胞的拉曼光譜

4 結語

本文對六種拉曼光譜生物樣品承載基底材料進行了考察，分別發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿（聚丙烯）具有豐富且范圍寬的拉曼散射信號，石英玻璃（晶體二氧化硅）的拉曼光譜信號在低波數有明顯的干擾，藍寶石（三氧化二鋁）、載玻片（鈉鈣玻璃）和氟化鈣有明顯的發(fā)光光譜信號，只有氟化鋇既無寬范圍的拉曼光譜信號，也無明顯的發(fā)光光譜信號。通過上述考察過程，可以明確拉曼光譜生物樣品承載基底的選擇標準為：1）該基底材料的拉曼散射信號必須微弱或信號不影響生物材料的信號區(qū)域，以避免潛在的背景干擾；2）基底材料在具備微弱拉曼散射信號的同時，不應有明顯的發(fā)光特性，特別是發(fā)光信號不能落在拉曼光譜的檢測范圍內。上述選擇標準的確立，能夠為拉曼光譜在日益增多的生物類材料的分析檢測中起到實驗指導作用，從而提升生物樣品的定性定量檢測的準確性，進而促進拉曼光譜更廣泛的運用。

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