王施元，李肖肖，于彩虹，王珊，尹曉靜，劉羽，王芳芳，王瑞靜，劉梅梅*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，哈爾濱 150000；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，濟(jì)寧 272029；3.石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000；4.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，新鄉(xiāng) 453000；5.朝陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，朝陽 122000；6.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是由神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及代謝紊亂而引起的一種以排卵功能紊亂和高雄激素血癥為特征的疾病[1]。臨床上，PCOS主要表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、不孕、多毛和肥胖，在育齡期婦女中發(fā)病率高達(dá)4%～12%。有研究顯示，未及時(shí)治療的PCOS患者將增加Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、高血脂、冠心病及子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前PCOS發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCOS患者存在下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的功能調(diào)節(jié)障礙，也有研究認(rèn)為生長(zhǎng)激素(GH)對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸具有一定的調(diào)節(jié)作用，影響卵巢的成熟及卵泡的周期性發(fā)育。同時(shí)，PCOS患者也存在GH分泌異常的現(xiàn)象。目前PCOS的研究除在婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域方面外，也涉及免疫學(xué)、基因?qū)W及卵巢血管異常生成等領(lǐng)域。有研究證實(shí)[3]，PCOS患者血清中血管相關(guān)因子——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平升高，提示PCOS可能與血管生成異常改變相關(guān)。在我們之前關(guān)于PCOS大鼠的研究結(jié)果也提示[4]，PCOS的發(fā)生可能與血管生成密切相關(guān)。已知，血管形成相關(guān)因子內(nèi)皮抑素(ES)、內(nèi)皮素-1(ET-1)及血小板反應(yīng)素-1(TSP-1)的相互作用參與了血管生成。在本研究中我們擬在原實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過來曲唑灌胃法誘導(dǎo)PCOS大鼠模型，檢測(cè)血清與卵巢組織中ES、ET-1及TSP-1的表達(dá)情況，及應(yīng)用GH后PCOS大鼠血清及卵巢組織中ES、ET-1及TSP-1表達(dá)水平的變化，試圖從血管生成方面探討GH在PCOS發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取6周齡SD 雌性大鼠70只，體質(zhì)量(160±10)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[合格證號(hào)：SCXK(黑)2015-001)]。

2. 主要試劑和藥物：來曲唑(Letrozole，江蘇瑞恒醫(yī)藥)；羧甲基纖維素(膠州漿糊粉廠)；生長(zhǎng)激素(長(zhǎng)春金賽藥業(yè))；內(nèi)皮抑素抗體(Endostatin Antibody)、血小板反應(yīng)素-1抗體(THBS1 Antibody、多聚體抗兔IgG-HRP(武漢博士德)；內(nèi)皮素-1抗體(Rabbit Anti-ET1 antibody)(北京博奧森)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 動(dòng)物模型制備與分組：飼養(yǎng)條件：室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，顆粒飼料和自來水喂養(yǎng)，自由飲食，12 h/12 h晝夜明暗交替(日光燈照明)。將70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組20只，模型組50組。模型組給予來曲唑1 mg/(kg·d)，溶于1% 羧甲基纖維素(CMC)中，灌胃21 d；同期對(duì)照組給予等量的1% 的CMC灌胃；所有入組動(dòng)物均每日行陰道涂片監(jiān)測(cè)動(dòng)情周期的變化。雌性動(dòng)物在正常生理周期內(nèi)或者非妊娠的情況下，每間隔一段時(shí)間都會(huì)有一次發(fā)情現(xiàn)象，這種情況被稱為雌性動(dòng)物的發(fā)情周期。將雌鼠固定，暴露陰道口，將蘸有生理鹽水的棉簽伸入陰道口，輕輕來回轉(zhuǎn)動(dòng)，涂抹在載玻片上，顯微鏡下進(jìn)行發(fā)情周期觀察并記錄。灌胃21 d后，模型組隨機(jī)抽取10只處死，采取頸總動(dòng)脈血并摘取雙側(cè)卵巢組織。通過檢測(cè)大鼠動(dòng)情周期鑒定及對(duì)比、顯微鏡下觀察卵巢的形態(tài)學(xué)變化評(píng)估造模效果。當(dāng)造模成功率>80%時(shí)，將模型組余下大鼠隨機(jī)分為生長(zhǎng)激素組(GH組 20只)和PCOS組(PCOS組 20只)，GH組皮下注射rhGH，劑量為1 U/(kg·d)(給藥劑量按照人與大鼠公斤體重折算系數(shù)計(jì)算)，溶于生理鹽水中；PCOS組與對(duì)照組注射等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)21 d。

2. 標(biāo)本采集與處理：不同組大鼠喂養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，用止血鉗固定大鼠四肢，剔除一側(cè)頸部皮毛，逐層分離暴露頸總動(dòng)脈，切斷動(dòng)脈取血3 ml，置于離心管中，室溫靜置30 min 后置于離心機(jī)中，以3 000 r/min，離心15 min，收集血清，分裝后置于-20℃冰箱待檢。取大鼠雙側(cè)卵巢，剔除周圍脂肪組織并稱重，迅速置于10%甲醛溶液中固定，以卵巢橫切面作為待檢平面行石蠟包埋。以上課題實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過我院倫理委員會(huì)論證。將石蠟包埋標(biāo)本制成常規(guī)切片，切片脫蠟至水后，95℃水浴中抗原修復(fù)，加入1∶100稀釋的ES一抗、1∶200稀釋的ET-1一抗、1∶100稀釋的TSP-1一抗。依次加入即用型二抗作用，DAB顯色。以抑制陽性片為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

3. 檢測(cè)指標(biāo)：(1)大鼠動(dòng)情周期鑒定及對(duì)比；(2)模型組動(dòng)物卵巢形態(tài)學(xué)鑒定；(3)ELISA法檢測(cè)大鼠血清ES、ET-1、TSP-1水平；(4)免疫組化法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織中的ES、ET-1及TSP-1的表達(dá)，細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞染色深淺和陽性細(xì)胞百分率作為結(jié)果進(jìn)行判定。顯色深淺：不顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。陽性細(xì)胞百分率：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<25 %為1分，陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為3分。二者得分相加，0分表示陰性(-)，1～2分表示弱陽性(+)，3～4分表示陽性(++)，5～6分表示強(qiáng)陽性(+++)。結(jié)果判斷在雙盲下進(jìn)行，切片結(jié)果均由兩位以上病理專家審閱評(píng)定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

大鼠血清ES、ET-1、TSP-1表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件。因大鼠隨機(jī)分成3組，每組均有不同的處理，故需首先采用單因素方差分析，其后運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩間的多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組織化學(xué)結(jié)果采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析，P<0.0001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠動(dòng)情周期鑒定及對(duì)比

模型組大鼠的動(dòng)情周期在應(yīng)用來曲唑12 d后均失去規(guī)律，處于動(dòng)情間期時(shí)相：鏡下少量白細(xì)胞和中間層細(xì)胞，未見角化細(xì)胞和上皮細(xì)胞。提示模型組無排卵。對(duì)照組大鼠仍存在正常的動(dòng)情周期變化，出現(xiàn)發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期等。

二、卵巢形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)10只隨機(jī)處死的模型組大鼠首先通過HE染色來觀察卵巢的形態(tài)學(xué)變化?？梢姶笫舐殉仓械亩?jí)卵泡結(jié)構(gòu)性萎縮，沒有黃體出現(xiàn)。以此判斷PCOS造模成功。

三、3組大鼠血清ES、ET-1、TSP-1的表達(dá)

與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清ES、ET-1表達(dá)升高，而TSP-1表達(dá)下降(P<0.05)；與PCOS組相比，GH組大鼠血清ES、ET-1表達(dá)下降，但未達(dá)到正常對(duì)照組水平(P<0.05)，GH組大鼠血清TSP-1表達(dá)升高，與對(duì)照組水平相接近(P>0.05)(表1)。

四、ES在3組大鼠卵巢組織中的表達(dá)比較

3組大鼠卵巢組織中，ES陽性表達(dá)的對(duì)照組有7例，PCOS組有19例，GH組有15例(圖1)。與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中ES表達(dá)水平增高(P<0.0001)；與PCOS組相比，GH組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞ES表達(dá)降低(P=0.0066)，但未達(dá)到正常對(duì)照組水平(P=0.0098)(表2)。

五、ET-1在3組大鼠卵巢組織中的表達(dá)

3組大鼠卵巢組織中，ET-1陽性表達(dá)者在對(duì)照組有8例，PCOS組有18例，GH組有15例(圖2)。與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中ET-1表達(dá)水平增高(P<0.0001)；與PCOS組相比，GH組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞ET-1表達(dá)降低(P=0.0134)，但未達(dá)到正常對(duì)照組水平(P=0.0390)(表2)。

六、TSP-1在3組大鼠卵巢組織中的表達(dá)

3組大鼠卵巢組織中，TSP-1陽性表達(dá)者在對(duì)照組有18例，PCOS組有7例，GH組有20例(圖3)。與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中TSP-1表達(dá)水平降低(P=0.0001)；與PCOS組相比，GH組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞TSP-1表達(dá)增加(P<0.0001)，與正常對(duì)照組水平相接近(P=0.6559)(表2)。

A：對(duì)照組(++)； B：PCOS組(+++)； C：GH組(+)圖1 大鼠卵巢組織中ES的表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×400)

A：對(duì)照組(++)； B：PCOS組(+++)； C：GH組(+)圖2 大鼠卵巢組織中ET-1的表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×400)

A：對(duì)照組(++)； B：PCOS組(-)； C：GH組(+)圖3 大鼠卵巢組織中TSP-1的表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×400)

組 別例數(shù)ES(ng/ml)ET-1(pg/ml)TSP-1(ng/ml)對(duì)照組20172.34±6.1277.24±3.14170.32±3.80PCOS組20244.61±7.80#133.82±2.40#135.26±1.60#GH組20189.23±9.50*94.79±6.12*169.76±3.67

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與PCOS組比較，*P<0.05

表2 大鼠卵巢組織中ES、ET-1及TSP-1的表達(dá)

討 論

一、GH與PCOS

GH主要由腺垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)糖、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝，其主要作用是促進(jìn)生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)代謝。盡管PCOS的病因尚不明確，但多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)為PCOS患者存在下丘腦-垂體-卵巢性腺軸功能調(diào)節(jié)障礙，且涉及了多種內(nèi)分泌生物分子的表達(dá)、代謝及信號(hào)通路異常[5]。研究發(fā)現(xiàn)GH可能通過對(duì)性腺軸的調(diào)節(jié)，影響卵巢的成熟及其卵泡的周期性發(fā)育。目前，GH在PCOS中促排卵作用成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)，GH可作用于卵巢上GH受體，與卵泡生成和黃素化、卵母細(xì)胞成熟、排卵等密切相關(guān)，其主要通過依賴和非依賴促性腺激素的機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給予GH后PCOS大鼠血清ES、ET-1的表達(dá)下降，TSP-1表達(dá)上升；在卵巢組織血管相關(guān)因子表達(dá)方面，表現(xiàn)為PCOS組大鼠卵巢組織中ES、ET-1高表達(dá)，TSP-1低表達(dá)；在應(yīng)用GH后，ES、ET-1的表達(dá)下降，但并沒有達(dá)到正常狀態(tài)，推測(cè)在PCOS中，GH可能通過調(diào)節(jié)大鼠血清與卵巢組織中ES及ET-1的表達(dá)而發(fā)揮作用，但抗血管生成因子與GH的關(guān)系目前尚不清楚，且GH在PCOS中具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

目前，關(guān)于GH的研究大多數(shù)集中于PCOS患者的促排卵中效果，而在PCOS中的具體作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予GH后，ES、ET-1在PCOS大鼠血清與卵巢組織中表達(dá)下降，而TSP-1的表達(dá)上升。血管生成相關(guān)因素在PCOS中的作用以及GH在PCOS中調(diào)節(jié)血管因子表達(dá)平衡的作用機(jī)制，均需要深入的研究探討，將為PCOS的治療開辟新的思路。

二、ES與PCOS

ES是一種特異性的抑血管生成因子，選擇性的作用于參與形成新生血管過程中的小血管內(nèi)皮細(xì)胞，其主要通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制血管內(nèi)皮增殖及抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移等途徑有效抑制新生血管的形成[6]。ES多與VEGF同時(shí)被探討，研究發(fā)現(xiàn)，ES能選擇性抑制內(nèi)皮細(xì)胞上一氧化氮合酶(eNOS) 的磷酸化，誘使eNOS失活，從而抑制VEGF介導(dǎo)的血管新生和血管通透性增加作用[7]。已有研究表明，血管生成需要多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)[8]，PCOS患者血清ES水平與VEGF呈正相關(guān)，表明二者在調(diào)節(jié)血管生成方面有著重要相關(guān)性。異常升高的VEGF促進(jìn)機(jī)體血管生成的同時(shí)，為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機(jī)體同時(shí)分泌大量的血管生成抑制劑如ES以抗衡高水平的血管生成趨勢(shì)，從而導(dǎo)致ES在PCOS患者體內(nèi)增多，但這種代償作用仍不能使卵巢微環(huán)境達(dá)到正常的生理狀態(tài)，從而可能導(dǎo)致卵巢囊性增生，常表現(xiàn)為包膜增厚，及卵泡囊的血管增生引起的卵巢增大、充血為主[9]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，PCOS組大鼠血清與卵巢組織中ES的表達(dá)升高，與我們之前的研究結(jié)果相符[10]。我們的研究結(jié)果還提示[8]PCOS患者由于ES與VEGF的表達(dá)失衡而導(dǎo)致卵巢間質(zhì)血管化、卵泡周圍血管新生，卵巢血流豐富呈現(xiàn)多囊狀態(tài)，從而導(dǎo)致PCOS的病理生理損害進(jìn)一步發(fā)展。可見，ES在PCOS 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的血管抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，GH組大鼠血清與卵巢組織中ES的表達(dá)下降，但未達(dá)到正常對(duì)照組水平，據(jù)此推測(cè)，GH可能通過調(diào)節(jié)大鼠血清與卵巢組織中ES與VEGF的表達(dá)，進(jìn)而在PCOS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

三、ET-1與PCOS

ET-1是多肽類家族中一員，可涉及多個(gè)生物學(xué)過程[11]，研究證實(shí)ET-1通過與卵巢組織內(nèi)的相應(yīng)受體結(jié)合從而調(diào)節(jié)血管的舒縮活動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢血流的調(diào)控[12]，還能通過刺激NADPH(還原型輔酶Ⅱ)氧化酶的活性來增加體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，使NO所介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張作用受抑制，導(dǎo)致血管舒縮障礙[13]。有研究表明，PCOS患者血清中ET-1表達(dá)升高，NO水平降低[14]，對(duì)內(nèi)皮有損害作用的ET-1和對(duì)血管有保護(hù)作用的活性分子NO表達(dá)水平的失衡而增加了血管內(nèi)皮損傷。Imbar等[15]研究發(fā)現(xiàn)ET-1 mRNA在PCOS患者顆粒黃體細(xì)胞中的表達(dá)是排卵正常女性的兩倍，由此認(rèn)為其可能與PCOS患者的排卵障礙有關(guān)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCOS大鼠血清與卵巢組織中ET-1的表達(dá)高于對(duì)照組，GH作用后ET-1的表達(dá)下降，但未達(dá)到正常對(duì)照組水平。也有學(xué)者認(rèn)為PCOS患者ET-1血清表達(dá)水平與正常女性并無明顯差別[16]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不相同，可能與研究對(duì)象的不同(本實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn))、我們研究例數(shù)較少等因素有關(guān)。據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在PCOS的發(fā)生發(fā)展中，GH可能通過調(diào)節(jié)大鼠血清與卵巢組織中ET-1的表達(dá)而發(fā)揮一定的作用。

四、TSP-1與PCOS

TSP-1抑制血管生成包括抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及通過抑制VEGF發(fā)揮作用。TSP-1缺乏的小鼠和對(duì)照組相比，產(chǎn)仔數(shù)減少，故TSP-1影響生殖系統(tǒng)。我們之前的另一項(xiàng)臨床研究表明，TSP-1的表達(dá)在PCOS患者血清中較正常人群低，且PCOS患者中合并有胰島素抵抗者的TSP-1表達(dá)水平較非胰島素抵抗者高[17]，這與本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。另有資料[18]表明，正常卵巢組織中卵巢顆粒細(xì)胞可以產(chǎn)生TSP-1，其主要作用卵巢顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)血管生成以及嚙齒類動(dòng)物卵巢卵泡和黃體發(fā)育，且與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的相關(guān)性。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清與卵巢組織中TSP-1表達(dá)下降；與PCOS組相比，GH作用后大鼠血清與卵巢組織中TSP-1的表達(dá)升高，但GH作用后的TSP-1和對(duì)照組相比，卻不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSP-1可通過影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖與凋亡、以及改變血管生成因子VEGF活性來抑制血管生成[19-20]。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，TSP-1其發(fā)揮抑制血管的作用與VEGF相互依賴，二者可能共同參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展，平衡制約著卵巢組織中血管生成的調(diào)節(jié)；GH可能通過調(diào)節(jié)TSP-1和VEGF的相互表達(dá)而在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

在目前關(guān)于GH調(diào)控PCOS大鼠血清與卵巢組織中相關(guān)血管因子表達(dá)的研究中，樣本量較小。關(guān)鍵在于GH調(diào)控PCOS的基礎(chǔ)研究不足，這是目前解決動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果瓶頸所在。從目前的結(jié)果來看GH和PCOS是具有一定的相關(guān)性的。

本研究評(píng)估了PCOS大鼠經(jīng)過GH治療后，血清與卵巢組織中相關(guān)血管因子表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，PCOS組大鼠血清及卵巢組織中ES和ET-1均為高表達(dá)，TSP-1低表達(dá)；與PCOS組大鼠相比，GH組大鼠血清及卵巢組織中ES和ET-1表達(dá)降低，而TSP-1表達(dá)升高。但仍需要更大樣本量的研究，以及GH和相關(guān)血管因子與PCOS關(guān)系的更為深層的研究。這可能將為PCOS的發(fā)病機(jī)制以及診療思路帶來新進(jìn)展。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 檀麗，彭巧捷，陳麗春. 維生素D輔助治療對(duì)多囊卵巢綜合征內(nèi)分泌代謝相關(guān)指標(biāo)及胰島素抵抗的影響[J]. 數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2016，29：1497-1499.

[2] Gao H，Meng J，Xu M，et al. Serum heat shock protein 70 concentration in relation to polycystic ovary syndrome in a non-obese Chinese population[J/OL]. Plos One，2013，8：e67727.

[3] Ng EHY，Chan CCW，Yeung WSB，et al. Comparison of ovarian stromal blood flow between fertile women with normal ovaries and infertile women with polycystic ovary syndrome[J].Hum Reprod，2005，20：1881-1886.

[4] 原振宇，劉梅梅，張艷華，等. 兩種多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型比較及來曲唑誘導(dǎo)的動(dòng)物模型卵巢組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素1的表達(dá)[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志，2015，38：124-128.

[5] 付竹霓，曲洪美，于曉艷，等. 多囊卵巢綜合征患者血清生長(zhǎng)激素釋放多肽及脂聯(lián)素的檢測(cè)及意義[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6：4051-4053.

[6] 王韌，侯立軍. VEGF和內(nèi)皮抑素對(duì)血管生成作用的研究進(jìn)展[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2011，40：2582-2585.

[7] Hajitou A，Grignet C，Devy L，et al. The antitumoral effect of endostatin and angiostatin is associated with a down-regulation of vascular endothelial growth factor expression in tumor cells[J]. FASEB J，2002，16：1802-1804.

[8] 劉梅梅，丁慧，尹曉靜，等. 多囊卵巢綜合征患者血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮抑素水平及對(duì)卵巢間質(zhì)血流的影響研究[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20：448-453.

[9] 趙鴻娟，王煜，王麗巖，等. 多囊卵巢綜合征患者卵泡液中分子異常的研究進(jìn)展[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24：166-169.

[10] 劉梅梅，李佩玲，尹曉靜，等. 血管生成相關(guān)因子內(nèi)皮抑素和血小板反應(yīng)素-1在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織中的表達(dá)及意義[J]. 疑難病雜志，2016，15：1178-1181.

[11] Khimji AK，Rockey DC. Endothelin--biology and disease[J]. Cell Signal，2010，22：1615-1625.

[12] Mancina R，Barni T，Calogero AE，et al. Identification，characterization，and biological activity of endothelin receptors in human ovary[J]. J Clin Endocrinol Metab，1997，82：4122-4129.

[13] Mancini F，Cianciosi A，Reggiani GM，et al. Endothelial function and its relationship to leptin，homocysteine，and insulin resistance in lean and overweight eumenorrheic women and PCOS patients： a pilot study[J]. Fertil Steril，2009，91：2537-2544.

[14] Schiffrin EL. Vascular endothelin in hypertension[J]. Vascul Pharmacol，2005，43：19-29.

[15] Imbar T，Klipper E，Greenfield C，et al. Altered endothelin expression in granulosa-lutein cells of women with polycystic ovary syndrome[J]. Life Sci，2012，91：703-709.

[16] Foltyn W，Strzelczyk J，Marek B，et al. Selected markers of endothelial dysfunction in women with polycystic ovary syndrome[J]. Endokrynol Pol，2011，62：243-248.

[17] Liu M，Gao J，Zhang Y，et al. Serum levels of TSP-1，NF-κB and TGF-β1 in polycystic ovarian syndrome(PCOS) patients in northern China suggest PCOS is associated with chronic inflammation[J]. Clin Endocrinol(Oxf)，2015，83：913-922.

[18] Rhee KS，Park JH，Kim HS，et al. Antiangiogenic treatment with thrombospondin-1 enhances primary tumor radiation response and prevents growth of dormant pulmonary micrometastases after curative radiation therapy in human melanoma xenografts[J]. Cancer Res，2003，63：4055-4061.

[19] Lawler PR，Lawler J. MolecularbBasis for the regulation of angiogenesis by thrombospondin-1 and-2[J]. Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2：a006627.

[20] Claus C，Kazuichi M，F(xiàn)elix B，et al. Thrombospondin 1 inhibits inflammatory lymphangiogenesis by CD36 ligation on monocytes[J]. J Exp Med，2011，208：1083-1092.