王 威，曾 造*,2

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州 畢節(jié) 551700)

斑蝥素是從傳統(tǒng)中藥斑蝥蟲中提取出來(lái)的具有抗菌性藥物，它對(duì)腫瘤、癌癥具有很好的治療效果，具有增加白細(xì)胞數(shù)、不克制免疫系統(tǒng)等功效[1]。但是，斑蝥素有劇毒會(huì)對(duì)人體消化系統(tǒng)、肝臟等有很大的副作用[2]，這也限制了它在醫(yī)療上的推廣使用。斑蝥素的衍生物-去甲去氫斑蝥素酰亞胺類化合物具有良好的抗菌、抗癌、抗腫瘤等生物活性[3]，且該類藥物的毒性比斑蝥素低。研究表明，氟代苯甲醛可用于合成抗病毒藥、解熱鎮(zhèn)痛消炎藥[4]。為了合成藥用價(jià)值高、毒副作用小的新型藥物，本文以呋喃和順丁烯二酸酐為原料，合成對(duì)氟苯甲醛縮去甲去氫斑蝥素酰亞胺(a)，合成路線見(jiàn)圖1。并通過(guò)熒光光譜法研究了目標(biāo)化合物與牛血清蛋白的相互作用，探索其猝滅機(jī)理、猝滅常數(shù)和作用力類型等，為了解該類藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和作用機(jī)理等信息提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 目標(biāo)產(chǎn)物(a)合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

儀器：600 MHz 核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，瑞士 bruker 公司)；F-2007 FL 熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；超聲清洗儀(上海冠特超聲有限公司)；電子分析天平；冷凍藥品保存柜(中科美菱)。

藥品：四氫呋喃，呋喃，順丁烯二酸酐，對(duì)氟苯甲醛，牛血清蛋白(美國(guó)Sigma公司)，Tris-HCL緩沖溶液(含0.1 mol/L的NaCl)pH值=7.4，實(shí)驗(yàn)試劑保存在4℃下，備用。

1.2 目標(biāo)產(chǎn)物的合成

參照文獻(xiàn)[5]稱取9.80 g(0.1 mol)順丁烯二酸酐于反應(yīng)容器中，加入適量的乙醚使其全部溶解。在室溫下滴加8.70 mL(0.12 mol)呋喃并不斷攪拌25 min，密封靜置過(guò)夜，有白色晶體析出，過(guò)濾，稱重得12.6 g白色針狀晶體物質(zhì)去甲去氫斑蝥素(1)，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，產(chǎn)率66.7%。參照文獻(xiàn)[6]的合成方法，稱取1.66g(0.01 mol)去甲去氫斑蝥素于100 mL的三頸燒瓶中，加入適量的無(wú)水乙醇使其剛好溶解，待化合物(1)全部溶解后，緩緩滴加1.00 g(0.02 mol)水合肼，加熱回流20 h，冷卻結(jié)晶抽濾，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶、干燥稱重得1.2 g的白色產(chǎn)物N-氨基去甲去氫斑蝥素酰亞胺(2)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]的合成方法，稱取1.08 g化合物(2)于250 mL的三頸燒瓶中，加入適量的無(wú)水乙醇使其全部溶解，加入6.00～1.2 mmol的對(duì)氟苯甲醛，用TLC追蹤反應(yīng)，加熱回流5h，冷卻結(jié)晶后抽濾，以無(wú)水乙醇為溶劑加熱溶解重結(jié)晶，干燥后得目標(biāo)產(chǎn)物a。

1.3 熒光分光實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL容量瓶中加入1.0 mL Tris-HCL溶液(pH值=7.4)、1.0 mLBSA溶液和不同體積的去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對(duì)氟苯甲醛溶液，并用超純水定容，搖勻靜置15 min。分別在290、300、310 K的恒溫水浴鍋中恒溫40 min,發(fā)射狹縫和激發(fā)狹縫的寬度都為5 nm，以286為激發(fā)波長(zhǎng)在300～450 nm掃描產(chǎn)物a與BSA混合液的熒光發(fā)射光譜[8]。

2 實(shí)驗(yàn)分析與結(jié)果

2.1 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

去甲去氫斑蝥素(1)，收率66.7%，m. p.117.4～119.3 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：6.62(d，2H，J=0.6 Hz，CH=CH)；5.28(s，2H，HCOCH)；3.20(s，2H，HCCH)，去甲去氫斑蝥素(1)的熔點(diǎn)、氫譜與參考文獻(xiàn)[3]相符合。N-氨基去甲去氫斑蝥素酰亞胺(2)為白色固體，m.p.137.3 ～ 139.4 ℃(文獻(xiàn)值[9]為139 ～ 140.5 ℃)。對(duì)氟苯甲醛縮氨代去甲去氫斑蝥素白色晶體，產(chǎn)率43%。m.p.156.5～157.8 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：9.06(s，1H，N=CH)；7.97(s，2H，Ar-H)；7.28(s，2H，Ar-H)；6.64(d，2H，J=9.6 Hz，CH=CH)；5.25(s，2H，HCOCH)；3.14 (s，2H，HCCH)。13C NMR((CH3)2CO-d6，150 MHz)，δ：48.48，79.15，115.92，129.99，130.74，136.33，160.54，164.15，173.09。

2.2 目標(biāo)產(chǎn)物與BSA的猝滅機(jī)理

2.2.1 熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)分子中主要有苯丙氨酸、色氨酸等一系列殘基產(chǎn)生的內(nèi)源熒光，在波長(zhǎng)為286 nm光的激發(fā)作用下，340 nm左右會(huì)出現(xiàn)色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光發(fā)射峰。實(shí)驗(yàn)中，固定BSA濃度不變，加入相同濃度不同體積的對(duì)氟苯甲醛去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮溶液進(jìn)行熒光檢測(cè)，可得到熒光猝滅譜圖。由圖2可以看出，隨著藥物濃度的增大，BSA的最大熒光強(qiáng)度有一定規(guī)律變化，其變化為隨著濃度的增大而減小，說(shuō)明去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對(duì)氟苯甲醛對(duì)BSA有猝滅作用。

1～7：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(C(a) =5)圖2 產(chǎn)物對(duì)BSA的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of product-BSA

2.2.2 猝滅機(jī)理與常數(shù)

藥物對(duì)BSA的猝滅作用分為動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅。對(duì)動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高，基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性減小，猝滅常數(shù)也隨之減??；對(duì)靜態(tài)猝滅，隨著溫度的增高，猝滅常數(shù)增大。藥物對(duì)BSA的作用過(guò)程遵循Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KqT0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1)中，Ksv是猝滅常數(shù)；F0是BSA溶液的熒光強(qiáng)度；F是加入藥品后BSA溶液的熒光強(qiáng)度；Kq是雙分子猝滅的速率常數(shù)；[Q]是猝滅劑Q的濃度；T0是猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命，約等于10-8s。根據(jù)方程式(1)，作去甲去氫斑蝥素酰亞胺縮對(duì)氟苯甲醛對(duì)BSA猝滅的Stern-Volmer曲線(圖3)，直線斜率為猝滅常數(shù)。由圖3可知，290、300和310 K的Ksv分別為3.08×104L/mol(R=0.9979)、3.73×104L/mol(R=0.9918)、3.92×104L/mol(R=0.9948)。隨著溫度的升高，BSA的猝滅常數(shù)升高，可以推出該過(guò)程是動(dòng)態(tài)猝滅?？梢愿鶕?jù)Ksv= KqT0計(jì)算出相應(yīng)的Kq等于3.08×1012、3.73×1012、3.92×1012L/(mol·s)。Kq值均大于生物分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)(2.0×1010L/(mol·s),這可以得出目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)BSA的熒光猝滅作用包含了靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩類。

圖3 目標(biāo)產(chǎn)物與BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.3 The Stern-volmer curves of fluorescence of BSA quenching by target products

2.2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)BSA存在靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，由此我們可以用靜態(tài)猝滅公式(2)計(jì)算其結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

Lg[(F0-F)/F]=KA-nLg [Q]

(2)

[(F0-F)/F]對(duì) [Q]作圖(圖4)，由圖中的截距可以求DNCT與BSA的KA值，直線斜率可以算出兩者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果如表1所示。

圖4 不同溫度下產(chǎn)物對(duì)BSA的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of the product-BSA at different temperatures

表1 產(chǎn)物與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab.1 The binding constant and binding points for the system of product -BSA

2.2.4 相互作用力

分子之間的主要作用力有范德華力、疏水作用力、靜電引力等。Ross的判斷規(guī)則如下：當(dāng)Δ S<0，ΔH<0，主要表現(xiàn)為范德華力；當(dāng)ΔS>0，ΔH>0，主要表現(xiàn)為疏水作用力；當(dāng)ΔS>0，ΔH<0，主要表現(xiàn)為靜電作用力。當(dāng)溫度變化范圍很小時(shí)，我們可以把熒光猝滅進(jìn)程中的ΔH看為常數(shù)，根據(jù)下面的三個(gè)方程式計(jì)算出ΔH、ΔS，由此就可以判斷產(chǎn)物與牛血清蛋白的作用力類型。

ΔG=-RTlnK

(3)

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

根據(jù)290、300、310 K三個(gè)溫度下計(jì)算出的結(jié)合常數(shù)，我們可以計(jì)算出目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用的熱力函數(shù)值，值見(jiàn)表2。根據(jù)表中的值可以得出目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白之間是通過(guò)疏水作用力而結(jié)合在一起的，并且ΔG<0我們可以得出他們之間是吸熱熵增加的自發(fā)過(guò)程。

表2 目標(biāo)產(chǎn)物和BSA的熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters of BSA- product

2.3 同步熒光分析

因?yàn)榘被釟埢淖畲蟛ㄩL(zhǎng)容易受到微環(huán)境的影響，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用同步熒光光譜分析其分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。固定波長(zhǎng)差分別為Δλ=15 nm與Δλ=60 nm的同步熒光能分別體現(xiàn)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的構(gòu)象變化。有圖5可知，當(dāng)隨著藥物濃度增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的均產(chǎn)生熒光猝滅，但Δλ=60 nm色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)略有紅移，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。

圖5 同步熒光光譜Fig.5 Synchronocs fluorescenee speetra

3 結(jié)論

本文合成了對(duì)氟苯甲醛縮去甲去氫斑蝥素酰亞胺，并且通過(guò)熒光光譜法研究了其與牛血清蛋白之間的相互作用。研究表明，目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白之間存在兩種猝滅作用即靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅。在290、300和310 K溫度下，目標(biāo)產(chǎn)物與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為3.37×104，2.7×104，2.69×104L/mol和0.947,1.16,1.20；并且它們之間是通過(guò)疏水結(jié)合力結(jié)合在一起。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為該類藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布和藥物活性提供一些參考價(jià)值。

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