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原花青素對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

2018-05-10 07:22胡亞美孫敬春梁國(guó)棟褚瑰燕楊公社
中國(guó)畜牧雜志 2018年5期
關(guān)鍵詞:頂體質(zhì)膜活率

胡亞美,劉 斌,孫敬春,梁國(guó)棟,褚瑰燕,楊公社*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.大荔縣眾康家畜良種繁育有限公司,陜西大荔 715103)

目前,國(guó)外主要集中于對(duì)豬精液冷凍保存的理論研究[1-2],而國(guó)內(nèi)對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的常溫保存為主要研究趨勢(shì)。由于豬精子質(zhì)膜上多不飽和脂肪酸含量豐富,當(dāng)遇到活性氧族(ROS)攻擊時(shí),易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),造成精子氧化應(yīng)激,使其失去受精能力[3]。正常情況下,精漿中含有抗氧化物質(zhì),足以維持ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡,但在精液稀釋保存的過(guò)程中,精漿中抗氧化物質(zhì)濃度降低,平衡被打破,ROS無(wú)法及時(shí)有效地被清除,使精子產(chǎn)生氧化損傷。因此,在精液稀釋保存過(guò)程中需要添加適量的抗氧化劑,增強(qiáng)精子的抗氧化能力,盡可能降低ROS對(duì)精子造成的傷害是很有必要的。

近年來(lái),天然抗氧化劑作為一類(lèi)無(wú)毒、安全的抗氧化劑逐漸引發(fā)關(guān)注,其具有重要的生物活性。謝東祺等[4]研究發(fā)現(xiàn),茶多酚、維生素C都能有效提高豬精液保存效果。原花青素(OPC)是一種生物類(lèi)黃酮,是目前發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)生物活性的天然抗氧化劑,其抗氧化能力雖亞于蝦青素,但優(yōu)于維生素C和維生素E,且其提取相對(duì)容易,生物利用安全性較高[5]。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典豬精液稀釋液BTS中添加不同濃度的OPC,并在保存過(guò)程中檢測(cè)豬精子抗氧化相關(guān)指標(biāo),分析OPC對(duì)豬精液常溫保存效果的影響,篩選出適宜的OPC添加濃度,為促進(jìn)豬精液稀釋粉的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論參考,為開(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的稀釋粉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 精液來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)所用精液采自楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地3頭健康的12月齡關(guān)中黑豬,使用手握法采精,收集射精中段富集精子部分,濾紙過(guò)濾后置于保溫瓶中,30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,所采原精活力鏡檢達(dá)0.8以上,氣味和色澤正常者方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 原花青素,純度≥95%,為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、二水合檸檬酸三鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸氫鈉為廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(100 T/50樣)、丙二醛(MDA)試劑盒(100 T/50樣)為南京建成科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀 器設(shè)備 17℃恒溫箱(1005c,康佳電器有限公司);豬精液計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)(CASA)(HVIE-SSW V8.0,福州鴻視野軟件技術(shù)有限公司);精子密度分析儀(Modelo V11,葡萄牙艾普森(北京)有限公司)多功能酶標(biāo)儀(Synergy H1,美國(guó)伯騰儀器有限公司)等。

1.4 BTS稀釋液的配制 配方:葡萄糖37.15 g/L,檸檬酸鈉6.00 g/L,EDTA 1.25 g/L,碳酸氫鈉1.25 g/L,氯化鉀0.75 g/L,用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)量后配制成BTS基礎(chǔ)稀釋液。

1.5 精 液稀釋與保存 將采集的公豬精液與稀釋液在水浴鍋內(nèi)平衡10 min(溫度差不超過(guò)1℃),再將稀釋液沿瓶壁或者玻璃棒緩慢倒入精液中,精液與稀釋液按1:4的比例稀釋?zhuān)♂屍陂g需輕輕晃動(dòng)或用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌,使其混合均勻。稀釋后的精子密度為1.85億/mL,然后將稀釋好的精液分裝到已滅菌的10 mL離心管中,用毛巾包裹后放置在17℃恒溫箱中避光保存,保存過(guò)程中除每次檢測(cè)外不翻動(dòng)離心管。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分8組,以配制的BTS基礎(chǔ)稀釋液為對(duì)照組,設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組,即基礎(chǔ)液中分別添加10、20、30、40、50、60、70 μg/mL OPC。17℃ 保存,每隔24 h檢測(cè)1次精子活率、頂體和質(zhì)膜完整率,每隔48 h檢測(cè)1次T-AOC和MDA含量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 精子常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 精子活率利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)檢測(cè);質(zhì)膜完整性利用精子尾部低滲腫脹實(shí)驗(yàn),各組精子每隔24 h測(cè)定1次;檢測(cè)精子頂體完整率使用異硫氰酸熒光素-花生凝集素(FITCPNA)熒光染料對(duì)精子進(jìn)行染色鏡檢,每隔24 h檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組頂體完整率。實(shí)驗(yàn)全程避光操作。

1.8 精子生化指標(biāo)檢測(cè) T-AOC活性和MDA含量嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),處理結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)豬精子活率的影響由表1可知,將OPC添加到BTS基礎(chǔ)稀釋液中,第0天和第1天的精子活率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05);第2天對(duì)照組的精子活率與10 μg/mL OPC組差異不顯著(P>0.05),而顯著低于其余實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);第3~5天對(duì)照組精子活率均顯著低于7個(gè)實(shí)驗(yàn)組(P<0.05);第 5天添加 30、40、50、60 μg/mL OPC組精子活率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

2.2 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)豬精子質(zhì)膜完整性的影響 由表2可知,第0天,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的精子質(zhì)膜完整率無(wú)顯著差異(P>0.05),隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),各組間的精子質(zhì)膜完整性開(kāi)始出現(xiàn)差異。第3天,40 μg/mL OPC組的精子質(zhì)膜完整率最高且顯著高于對(duì)照組和 10 μg/mL OPC 組(P<0.05)。第 4~5 天,50 μg/mL OPC組精子質(zhì)膜完整率最高且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)OPC添加量從10 μg/mL增加至50 μg/mL時(shí),精子質(zhì)膜完整率呈上升趨勢(shì),大于50 μg/mL后開(kāi)始下降,當(dāng)添加量增至70 μg/mL時(shí),與對(duì)照組基本無(wú)顯著差異(P>0.05)。由此可見(jiàn),添加一定量OPC可保護(hù)精子質(zhì)膜,但當(dāng)濃度過(guò)高時(shí),保護(hù)作用減弱。

2.3 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)豬精子頂體完整性的影響 由表3可知,第0天,20 μg/mL OPC組頂體完整率最高,且顯著高于對(duì)照組和10 μg/mL OPC組(P<0.05)。第1天,添加50 μg/mL OPC組頂體完整率最高。從第3天開(kāi)始,對(duì)照組和10 μg/mL OPC組的精子頂體完整性與其余組差異顯著(P<0.05)。第5天,對(duì)照組頂體完整率已趨近70%,且顯著低于7個(gè)實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。整體而言,OPC添加量為50 μg/mL時(shí)頂體完整率最高,相對(duì)于40 μg/mL OPC組可更穩(wěn)定地保護(hù)精子頂體完整性。

表1 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)精子活率的影響 %

2.4 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)豬精子T-AOC和MDA濃度的影響 由表4可知,隨著B(niǎo)TS基礎(chǔ)稀釋液中OPC添加濃度增大,精子T-AOC活性越強(qiáng)。但第5天,對(duì)照組和10、20 μg/mL OPC組的T-AOC活性顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),且添加量為70 μg/mL時(shí)活性最高,為1.44 U/mL。稀釋精液中MDA含量隨OPC添加量的增加而減少,第5天,70 μg/mL OPC組的MDA含量最低,且顯著低于對(duì)照組和10、20、30、40 μg/mL OPC 組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 OPC對(duì)豬精子活率、質(zhì)膜和頂體完整性的影響 豬精液稀釋和保存過(guò)程中無(wú)法完全隔絕空氣,在17℃保存條件下,精子活動(dòng)頻率減慢,但仍會(huì)耗能和代謝。此過(guò)程中,精子尾部中段大量的線(xiàn)粒體負(fù)責(zé)供能的同時(shí),會(huì)產(chǎn)生ROS,少量ROS是精子生存所必需的,但積累過(guò)量會(huì)引發(fā)其產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)。精子中除線(xiàn)粒體外,質(zhì)膜也是內(nèi)源性ROS主要來(lái)源之一[6]。

表2 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)精子質(zhì)膜完整性的影響 %

表3 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)精子頂體完整性的影響 %

表4 BTS基礎(chǔ)稀釋液中添加OPC對(duì)精子T-AOC和MDA的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),豬精液常溫保存過(guò)程中添加OPC可顯著提高精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性,且添加量為50 μg/mL時(shí)效果最佳,這一結(jié)果與孫艷青等[7]在豬冷凍精液中添加OPC所得結(jié)果類(lèi)似,但在常溫保存精液中所需添加濃度略高。產(chǎn)生此差異的原因可能是豬精液冷凍保存過(guò)程較復(fù)雜,需經(jīng)過(guò)離心、降溫、升溫等一系列長(zhǎng)時(shí)間的操作,且在冷凍前會(huì)添加冷凍保護(hù)劑以減少降溫造成的精子機(jī)械損傷[8]。冷凍保護(hù)劑的添加使得添加40 μg/mL OPC即可清除多余的ROS[7]。但在常溫保存環(huán)境中,精子代謝持續(xù)進(jìn)行,會(huì)產(chǎn)生更多的ROS,且無(wú)其余保護(hù)劑的協(xié)助效應(yīng),所以需要添加較多的OPC來(lái)清除過(guò)量的ROS。因此,在常溫保存過(guò)程中添加50 μg/mL OPC才有較佳的效果。本實(shí)驗(yàn)中,質(zhì)膜完整率變化隨著OPC添加濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),可能是由于精液在常溫保存前期,稀釋液中有害物質(zhì)積累較少,隨保存時(shí)間的延長(zhǎng),死精子數(shù)增加,少量抗氧化劑已不能及時(shí)清除產(chǎn)生的ROS,需增大OPC添加量以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激;當(dāng)添加的OPC濃度超過(guò)50 μg/mL之后,可能會(huì)引發(fā)精子凋亡,反而會(huì)降低精子質(zhì)膜的完整性。

本實(shí)驗(yàn)中頂體完整率同質(zhì)膜完整率變化趨勢(shì)相似,精子頂體是特化細(xì)胞器,包裹在精子頭部,內(nèi)含用于穿破透明帶的水解酶[9]。當(dāng)頂體受損后,由于頂體酶、透明質(zhì)酸酶等提前釋放,精子失去穿卵能力,無(wú)法與卵細(xì)胞結(jié)合完成受精,同時(shí)很快失去運(yùn)動(dòng)能力。精子質(zhì)膜發(fā)生損傷,短時(shí)間內(nèi)不會(huì)對(duì)精子造成嚴(yán)重影響,主要是由于質(zhì)膜破損對(duì)精子尾部中段運(yùn)動(dòng)供能相關(guān)蛋白影響有限,不會(huì)給精子造成毀滅性打擊[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,頂體完整率>精子活率>質(zhì)膜完整率,可印證上述觀點(diǎn)。因此,添加適量OPC有助于豬精液常溫保存,但過(guò)量添加會(huì)引發(fā)精子凋亡,導(dǎo)致精子活率、質(zhì)膜和頂體完整性降低等。

3.2 OPC對(duì)豬精液中T-AOC活性及MDA含量的影響公豬的生殖系統(tǒng)包括由酶[超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(PHGPx)、硫氧還蛋白酶(TRX)、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(PRDX)、對(duì)氧磷酶1型(PON-1)和2型(PON-2)]和低分子量的抗氧化劑(L-谷胱甘肽或L-麥角硫因)組成的特殊抗氧化系統(tǒng)[11]。在正常情況下足以維持精液環(huán)境中的氧化-抗氧化平衡,但外界環(huán)境變化會(huì)打破原有的活動(dòng)秩序,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),造成精子損傷。ROS的產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)漿細(xì)胞構(gòu)象和完整性發(fā)生不可逆損傷,造成DNA損傷并加速細(xì)胞凋亡[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,精子T-AOC隨OPC添加濃度升高而增加,MDA含量隨添加量升高而降低,與Zhang等[13]在豬精液常溫保存中所得結(jié)果類(lèi)似。LPO代謝產(chǎn)生MDA類(lèi)有害物質(zhì)越多,精子抗氧化能力越低,受損越嚴(yán)重。綜合分析其原因有可能是添加天然抗氧化劑OPC到稀釋液中,其結(jié)構(gòu)中的酚性羥基能在液體環(huán)境中產(chǎn)生H+,H+作為無(wú)電子不穩(wěn)定的離子,會(huì)搶奪自由基上的電子以達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu),并使自由基失活,降低精子線(xiàn)粒體膜和脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),保證了精子發(fā)揮功能的完整性;另一方面,在本實(shí)驗(yàn)中,添加OPC會(huì)使精子T-AOC活性增強(qiáng),且添加量為70 μg/mL時(shí)活性最高,在保存第5天時(shí)可達(dá)1.44 U/mL??赡苁怯捎贠PC的添加激活了精液中的SOD、PHGPx、TRX等的活性,從而增強(qiáng)了精子T-AOC活性來(lái)保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激的損傷。但在此過(guò)程中涉及更深層次的機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在常溫保存稀釋液中添加OPC可顯著提高豬精液常溫保存時(shí)間和常溫保存質(zhì)量。當(dāng)添加量為50 μg/mL時(shí),保存效果最佳,在第5天精子活率、質(zhì)膜和頂體完整率分別達(dá)61.63%、41.88%和75.88%時(shí),T-AOC濃度為1.43 U/mL、MDA含量為2.37 nmol/mL。

參考文獻(xiàn):

[1] Estrada E, Rodriguez-Gil J E, Rocha L G,et al.Supplementing cryopreservation media with reduced glutathione increases fertility and proli fi cacy of sows inseminated with frozen-thawed boar semen [J]. Andrology, 2014, 2(1): 88-99.

[2] Wysocki P, Orzolek A, Strzezek J,et al.The activity of N-acetylbeta-hexosaminidase in boar seminal plasma is linked with semen quality and its suitability for cryopreservation[J].Theriogenology , 2015, 83(7): 1194-1202.

[3] 杜立銀, 劉鐵錚, 魯金波. 抗氧化劑在豬精液冷凍保存技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧雜志, 2008, 44(1): 47-50.

[4] 謝東淇, 楊公社, 胡建宏, 等. 茶多酚對(duì)豬精液常溫保存效果的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017,45(6): 24-29.

[5] 張慧文, 張玉, 馬超美. 原花青素的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2015, 36(5): 296-304.

[6] Sabeti P, Pourmasumi S, Rahiminia T,et al.Etiologies of sperm oxidative stress[J]. Iran J Reprod Med, 2016, 14(4): 231-240.

[7] 孫艷青, 李青旺, 耿果霞, 等. 葡萄籽原花青素對(duì)豬精液冷凍保存效果的研究[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 37(5): 46-51.

[8] 劉彪, 逯心玉, 劉忠華, 等. 精漿對(duì)豬精子冷凍效果影響的研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2012, 39(11): 161-164.

[9] 崔晶晶, 李蒙蒙, 董海濤, 等. 豬精子獲能、頂體反應(yīng)及冷休克對(duì)頂體酶抑制劑的影響[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2014(7): 40-43.

[10] 李濤, 熊前, 吳衍, 等. 精液質(zhì)量評(píng)定方法[J]. 黑龍江動(dòng)物繁殖, 2013, 21(3): 13-15,43.

[11] Orzolek A, Mietelska K, Wysocki P. Function of the antioxidant system in boar semen[J]. Med Weter, 2016 , 72(5): 291-297.

[12] Valcarce D G, Robles V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Soleasenegalensis spermatozoa[J].Reproduction, 2016, 152(5): 439-446.

[13] Zhang X, Liu Q, Hu J,et al.Effects of glutathione on sperm quality during liquid storage in boars[J]. Anim Sci J , 2016,87(10): 1195-1201.

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