劉俊伶，徐明，楊學兵，楊磊，莫開林*

(1. 東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 四川省林業(yè)科學研究院，四川 成都 610081)

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，雌雄異株，為我國特有的經(jīng)濟樹種之一[1]。適宜生長在陽光充裕、濕潤溫和的地方，在我國分布廣泛，主要分布在四川、云南、廣西、貴州、河南和長江中下游等地[2]。

杜仲傳統(tǒng)以樹皮入藥，因其資源較為匱乏，屬于我國名貴的中藥材，生產(chǎn)成本高。自然生長周期長，過度地剝皮會導致杜仲樹死亡，導致杜仲樹皮資源十分匱乏，遠遠不能滿足市場需求[3]?，F(xiàn)代研究證實，杜仲葉與其皮的藥用功能大致相同，提取物中有效成分也基本上相似，杜仲種植成活后，第3年就可以采收杜仲葉，且杜仲葉產(chǎn)量較大，資源豐富，因此，以葉代皮，可以彌補樹皮資源不足。杜仲葉在 2005 年也正式被收載于《中國藥典》，所以對杜仲葉的研究和生產(chǎn)應(yīng)用研究備受關(guān)注[4～6]。

目前，從杜仲葉和皮中現(xiàn)在已經(jīng)分離出15 種環(huán)烯醚萜類化合物，多以糖苷的形式存在。車葉草苷是杜仲葉中的一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有降壓、降血脂、保肝利膽、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老等藥用價值[7～9]。

超聲提取技術(shù)(UAE)作為一種比較先進的提取技術(shù)，相比傳統(tǒng)的提取方法具有很多的優(yōu)勢和特點。如提取時間短、節(jié)約溶劑、提取率高、應(yīng)用廣泛等。這些優(yōu)勢和特點使得超聲提取在中藥化學成分提取方面獲得了廣泛應(yīng)用。鑒于此，本文嘗試采用超聲輔助法從杜仲葉中提取車葉草苷，為杜仲葉的進一步深度利用提供技術(shù)支持[10,11]。

1 材料及儀器

杜仲鮮葉由四川省林業(yè)科學研究院提供，經(jīng)東北林業(yè)大學谷會巖副教授鑒定。車葉草苷(純度98%)、購于上海源葉生物科技有限公司，色譜級甲醇購于賽莫非世爾科技(中國)有限公司，分析純乙醇購于天津市天士力化學試劑有限公司。

安捷倫1 260 Infinity II Prime購于安捷倫科技(中國)有限公司；KQ-200VDB三頻數(shù)控超聲波清洗機購于昆山超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 原料的預處理

用碎菜機把新鮮的杜仲葉擠壓成碎末，冷藏備用。

2.2 車葉草苷含量測定

標準曲線的繪制：分別配制0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1的車葉草苷對照品溶液，HPLC檢測，繪制標準曲線，線性擬合方程式為：

Y=8 897.1x+ 638.3，R2=0.9994

(1)

式中：x為對照品的濃度(mg·mL-1)，Y為1 mg·mL-1標準液對應(yīng)的峰面積。

車葉草苷含量測定的方法如下：稱取杜仲葉碎末1.2 g(折干重0.33 g)溶于5 mL 70%的乙醇中，超聲提取獲得提取液，冷卻至室溫，HPLC檢測得峰面積。將峰面積代入標準曲線方程(1)得提取液中車葉草苷濃度。

杜仲葉中車葉草苷得率計算公式：

Y=vc/M×1000

(2)

式中：Y為得率(ug·g-1)；v為提取液的體積(mL)；c為提取液的濃度(mg·mL-1)；M為杜仲碎末的干重重量(mg)。

2.3 HPLC分析條件：

流動相為水(A)和甲醇(B)體系，梯度洗脫:0 min～10 min，5%～15%B；10 min ～45 min，15%～32%B；45 min～46 min，32%～60%B；46 min ～56 min，60%～60%B；56 min ～57 min，60%～5%B；57 min ～70 min，5%～5%B。

檢測波長：238 nm，進樣量：10 μl，柱溫：30℃，流速：1 mL·min-1。

2.4 超聲波輔助提取杜仲葉中的車葉草苷單因素試驗

精確稱取一定量碎菜機擠壓所得的新鮮杜仲葉碎末，溶于乙醇水溶液(車葉草苷化合物分子量較小，具有極性官能團，偏親水性。根據(jù)相似相容原理。提取車葉草苷應(yīng)選擇極性較強的溶劑，所以本實驗以乙醇水溶液最為溶劑)，超聲輔助提取，得到提取液，冷卻至室溫，0.45 μm濾膜過濾，HPLC檢測。在其他條件相同的情況下，分別改變提取時間、提取功率、乙醇的濃度、液料比，以得到最佳提取方案。

(1)乙醇濃度：選擇不同濃度的乙醇水溶液，精確稱取1.8 g杜仲碎末(折干重0.5 g)，分別加入5 mL所選的提取溶劑，混勻，超聲功率200 W提取30 min，冷卻，過濾，濾液HPLC檢測，代入公式，計算車葉草苷的得率。

(2)液料比：分別按照5 mL·g-1、10 mL·g-1、15 mL·g-1、20 mL·g-1、25 mL·g-1的液料比，精確稱取，加入最佳濃度的乙醇水溶液，在200 W超聲功率下，超聲30 min，濾出上清液，HPLC檢測，代入公式，計算車葉草苷的得率。

(3)超聲功率和超聲時間：選擇最佳液料比以及乙醇濃度，依次超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min；選擇不同的超聲功率80 W、120 W、160 W和200 W，濾出上清液，HPLC檢測，代入公式，計算車葉草苷的得率。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇濃度的影響

準確稱取新鮮的杜仲葉碎末1.8 g(折干重0.5 g)，加入10 ml的試管中，分別加入10倍(g·ml-1)的提取溶劑 (純水，10%乙醇，20%乙醇，30%乙醇，40%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇)，在相同的超聲條件下(超聲功率200 W)超聲提取30 min，測定峰面積，并計算車葉草苷的得率。

實驗結(jié)果(見圖1)可以看出得率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增高，當乙醇濃度達到70%時，得率至最高，但當乙醇濃度再提高時，得率卻有下降的趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是水對物料起溶脹作用。綜合考慮，當乙醇濃度為70%時為最優(yōu)提取濃度。

圖1 乙醇濃度的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration

3.2 液料比的影響

選擇70%乙醇溶液，在超聲功率為200 W條件下提取30 min，通過改變液料比，研究液料比對車葉草苷的率的影響。由圖2可以看出，隨著液料比變大，車葉草苷的得率也提高，但是當液料比超過15時，車葉草苷的得率反而下降，故液料比為15時是最優(yōu)條件。

圖2 液料比的影響Fig. 2 Effect of liquid-solid ratio

3.3 超聲功率和超聲時間的影響

提取溶劑為70%的乙醇溶液，液料比為15 mL·g-1，在不同的超聲功率條件下提取30 min(見圖3)，超聲功率在80 W～200 W時，車葉草苷的得率在超聲功率為160 W時最高，超聲功率過大或是太低，車葉草苷的得率都有所下降，因此選擇160 W作為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation power

提取溶劑為70%乙醇溶液，液料比為15 mL·g-1，在超聲功率160 W條件下通過改變超聲時間，隨著時間的延長，車葉草苷的得率提高，車葉草苷在40 min后增加的趨勢變緩，綜合考慮，超聲輻射時間40 min為最佳時間(見圖4)。

圖4 超聲時間的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation time

4 結(jié)論

實驗選擇乙醇水作為提取溶劑，測試了乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時間對車葉草苷得率的影響。通過單因素實驗得到最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度70%、液料比15 mL·g-1、超聲時間40 min、超聲功率160 W。超聲輔助提取方法具有時間短，提取效率高節(jié)約能源等優(yōu)點，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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