牛東玲，劉向才，李艷

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川 750021）（2.賀蘭山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，寧夏銀川 750200）

蓼子樸系菊科旋覆花屬多年生亞灌木植物，又名沙旋覆花。其營養(yǎng)繁殖能力極強(qiáng)，能很好地適應(yīng)惡劣的流沙環(huán)境，是一種優(yōu)良的固沙植物[1]，主要分布于我國西北部的寧夏、甘肅、青海、陜西和新疆等省區(qū)以及河北、山西北部和遼寧以西等地區(qū)，花及全草都可入藥，被用于治療外感發(fā)熱、小便不利、癰瘡腫毒和濕疹等[2]。蓼子樸在寧夏地區(qū)的野生資源儲(chǔ)量非常豐富，被當(dāng)?shù)刈鳛橐环N草藥廣泛使用。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)蓼子樸的化學(xué)成分已開展了深入的研究，報(bào)道了近五十種化合物，類型涉及黃酮類、甾醇類及倍半萜類等結(jié)構(gòu)類型的化合物[3～7]。近幾年生物活性研究發(fā)現(xiàn)，蓼子樸含有的倍半萜內(nèi)酯類化合物具有細(xì)胞毒方面的活性作用[4,6]。另有一些研究報(bào)道了蓼子樸的提取物對(duì)小菜蛾幼蟲、粘蟲和大皺鰓金龜?shù)染哂芯苁澈投練⒌男Ч鸞8～10]，并發(fā)現(xiàn)其提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)小麥赤霉、蘋果炭疽、辣椒疫霉、玉米大斑等多種植物病原菌有 100%的抑制率[11]，但具體是什么成分在發(fā)揮作用未作研究。

植物精油（Plant Essential Oil）是一種從植物不同組織如果實(shí)、葉片、花和根中提取的揮發(fā)性液體，具有強(qiáng)烈的氣味和香味，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同分為脂肪族、芳香族和萜類以及它們的含氧衍生物，此外還有含氮和含硫的化合物。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物精油及其單組份具有很強(qiáng)的抑制或殺死細(xì)菌和真菌等微生物的特性，加之植物精油具有低毒和環(huán)境友好等特點(diǎn)，將其開發(fā)作為一種水果采后病害的天然殺菌劑，前景廣闊[12～14]。

本研究本著充分開發(fā)利用寧夏沙生植物資源的目的，選取在寧夏地區(qū)廣泛分布的野生沙生植物蓼子樸作為研究對(duì)象，采用現(xiàn)代的提取分離技術(shù)超臨界流體萃取法從蓼子樸花中獲取植物精油，通過體內(nèi)體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)研究蓼子樸花精油的抗菌活性，并對(duì)精油抗菌成分進(jìn)行了分析，以期為當(dāng)?shù)刂参锞皖愃ｕr劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

供試材料蓼子樸花在盛花期采集于寧夏中寧縣境內(nèi)，自然條件下陰干，粉碎過40目，貯于4 ℃冰箱備用。憑證標(biāo)本保存在寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院標(biāo)本室（NXAC）。新鮮的葡萄（紅提）果實(shí)于成熟期采摘于銀川郊區(qū)果園，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)選擇外觀圓潤、無受傷、無病害、健康的果實(shí)。

供試菌種蘋果炭疽菌（Glomerella cingulataSchr），番茄灰霉菌（Botrytis cirereaPers ex Tris），馬鈴薯干腐菌（Fusarium solani(Mart.) Sacc.）由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.1.2 儀器設(shè)備

普通光學(xué)顯微鏡，上海炳宇光學(xué)儀器有限公司；HP6890GC/5973氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；CO2超臨界流體萃取設(shè)備，海安華安超臨界設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；全自動(dòng)新型真空培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蓼子樸精油的提取

精確稱取115 g蓼子樸花樣品，利用CO2超臨界流體萃取裝置提取1.5 h，萃取壓力20 MPa，萃取溫度38 ℃，得到的精油，密封，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 蓼子樸精油體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 菌種純化

用配置好的PDA培養(yǎng)基（9個(gè)）進(jìn)行接種，將3個(gè)菌種于超凈工作臺(tái)中接種（Z字劃線接種）到PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后結(jié)合菌落形態(tài)特征，綜合分析是否供試菌是純培養(yǎng)。

1.2.2.2 孢子懸液的制備

確定為純培養(yǎng)后，在超凈工作臺(tái)中挑取適量菌，在斜面培養(yǎng)基上劃線，每種菌平行做3次，做好標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，在每個(gè)試管培養(yǎng)基中加入5 mL 0.85%的生理鹽水，輕輕晃動(dòng)，使孢子懸浮，形成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)算菌懸液中孢子的數(shù)目，用0.85%無菌生理鹽水控制菌懸液中孢子濃度在106個(gè)CFU/mL，待用。

1.2.2.3 蓼子樸精油溶液的配制

精確稱取蓼子樸精油100 mg，加適量的丙酮溶液稀釋（待精油完全溶解），用無菌水將精油溶液定容到100 mL，逐級(jí)倍比稀釋。

1.2.2.4 濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測定蓼子樸精油抑菌活性

采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法[15]對(duì)蓼子樸精油抑菌效力進(jìn)行測定。將經(jīng)斜面培養(yǎng)基上活化后的供試菌株，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，配制成 1×106CFU/mL的菌懸液。在無菌環(huán)境下操作，使用滅過菌的移液槍吸取三種菌懸液各 100 μL分別均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，備用。用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的小圓紙片，170 ℃干熱滅菌2 h后，將濾紙片浸潤配制好的蓼子樸精油稀釋液，將滅過菌的濾紙片浸潤等體積的丙酮溶液做為陰性對(duì)照。在無菌條件下將其貼在已涂布各種菌液的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)條件27 ℃，48 h。每種菌設(shè)3個(gè)平行組，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。培養(yǎng)結(jié)束后，以十字交叉法測定抑菌圈直徑大小，求其平均值。

1.2.2.5 蓼子樸精油最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用二倍稀釋法[16]，將精油液用丙酮溶液進(jìn)行倍比稀釋，在 PDA培養(yǎng)基中添加經(jīng)丙酮稀釋過的不同濃度（12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.13 mg/mL、1.56 mg/mL、0.78 mg/mL）的蓼子樸精油作為實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照培養(yǎng)基中添加丙酮作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將3種供試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化后，將供試菌種菌配成1×106CFU/mL的菌懸液，振蕩均勻，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中用無菌移液槍接種菌懸液0.1 mL，培養(yǎng)條件為27 ℃，培養(yǎng)48 h，若培養(yǎng)平板中出現(xiàn)菌落圈，則確定為微生物生長，若培養(yǎng)平板上完全無菌體生長，將無菌生長的樣品最低濃度確定為最小抑制濃度MIC。每個(gè)濃度及對(duì)照均設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.3 蓼子樸精油體內(nèi)抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 浸泡法

將一定量的蓼子樸精油加入到 1%吐溫-20中（4:1），充分乳化，再用無菌水稀釋成3.13、6.25、12.5 mg/mL的稀釋液，對(duì)照用蒸餾水。

將隨機(jī)挑選的果實(shí)（20個(gè)）用各濃度稀釋液浸泡1 min。撈出晾干，將水果置于PE保鮮袋中，密封，于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行貯藏，貯藏溫度為25 ℃，貯藏時(shí)間為12 d。每個(gè)處理分三個(gè)重復(fù)，每組隨機(jī)挑選20個(gè)果實(shí)。貯藏結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)腐爛等級(jí)，并計(jì)算其腐爛指數(shù)[17]。腐爛指數(shù)(%)=∑(腐爛等級(jí)×該等級(jí)果數(shù))/(最高腐爛等級(jí)×調(diào)查總果數(shù))×100

1.2.3.2 熏蒸法

取隨機(jī)挑選的果實(shí)20個(gè)為一組，分別裝入含精油原油0.5 mL、1 mL和1.5 mL的小瓶，瓶口向上放在保鮮袋中。對(duì)照為不加精油，袋口密封。于培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行貯藏，貯藏溫度為25 ℃，貯藏時(shí)間為12 d。每處理三個(gè)重復(fù)。貯藏結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)腐爛等級(jí)，并計(jì)算其腐爛指數(shù)。

1.2.4 蓼子樸精油成分分析

氣相色譜條件：Agilent HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦（99.999%），進(jìn)樣量為1 μL，流速為1 mL/min，分流比為30:1。程序升溫為在60 ℃保持3 min，以1 ℃/min升溫到80 ℃，再以3 ℃/min速率升溫到280 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，電離電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，MS四極桿溫度為150 ℃，接口溫度為250 ℃，溶劑延遲3.0 min，掃描范圍為35～500 u。標(biāo)準(zhǔn)譜庫Wiley NIST 05進(jìn)行檢索，峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsofe Excel 2013處理數(shù)據(jù)，利用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，顯著水平為p＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 蓼子樸精油的體外抑菌活性

2.1.1 蓼子樸精油的體外抑菌效果

采用抑菌圈大小評(píng)價(jià)三種受試菌對(duì)蓼子樸花精油的抗菌敏感性，當(dāng)精油濃度在100 mg/mL時(shí)，對(duì)三種果實(shí)采后病原菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）的抑制效果如表1所示。依據(jù)抑菌圈實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)[18]：直徑＞20.00 mm為極高敏，＞15.00 mm為高敏，＞10.00 mm為中敏，＞6.00 mm為低敏，等于6.00 mm為不敏感。顯然，蓼子樸精油對(duì)三種受試菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極高敏。李玉平等人[11]曾研究了蓼子樸全草的丙酮提取物對(duì)三種受試菌具有60%的抑制率，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和他們的一致。

表1 受試菌對(duì)蓼子樸精油的抗菌敏感性Table 1 Antifungal susceptibility of the tested microorganisms to essential oils of Inula salsoloides flowers

2.1.2 蓼子樸精油的最小抑菌濃度

蓼子樸精油對(duì)三種受試菌的MIC見表2。當(dāng)培養(yǎng)基中蓼子樸精油濃度為3.13 mg/mL時(shí)，三種受試菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）的生長均受到完全地抑制，平板上沒有菌落生長。因此，三種受試菌的MIC均為3.13 mg/mL。

表2 蓼子樸精油對(duì)三種受試菌的最低抑菌濃度Table 2 Mininal inhibitory concentration (MIC) of the essential oil of Inula salsoloides flowers for the three tested microorganisms

2.2 蓼子樸精油的體內(nèi)抑菌活性

2.2.1 蓼子樸精油浸泡處理后對(duì)葡萄采后自然腐爛的抑制效果

不同濃度的蓼子樸精油浸泡處理結(jié)果如表 3。采用精油浸泡處理的果實(shí)，腐爛等級(jí)相對(duì)較低。采用12.5 mg/mL蓼子樸精油浸泡處理的葡萄，腐爛指數(shù)為43.8%，與對(duì)照差異顯著（p＜0.01）。其它濃度處理后的水果腐爛指數(shù)和對(duì)照相比有所降低，但差異不顯著。顯然，浸泡法對(duì)于水果采后的防腐保鮮具有一定的作用，但由于精油溶液是由吐溫和水配置而成，浸泡后，在晾干的過程中，在水果表面不可避免地殘留有一定的水溶液，因而容易導(dǎo)致腐爛。

表3 蓼子樸花精油浸泡處理對(duì)葡萄自然腐爛的抑制效果Table 3 The rot rate of grape during storage after soaking treatment of essential oil solution from Inula salsoloides flowers

2.2.2 蓼子樸精油熏蒸處理后對(duì)葡萄自然腐爛的抑制效果

以熏蒸法處理結(jié)果如表 4。采用不同劑量的蓼子樸精油熏蒸處理后，對(duì)葡萄保鮮效果明顯，顯著地降低了水果的腐爛率。在精油量為0.5 mL時(shí)，葡萄僅有一級(jí)腐爛，腐爛指數(shù)為1.3%。隨著精油用量的增加，葡萄在整個(gè)貯藏期間保存完好，沒有任何腐爛現(xiàn)象的發(fā)生。貯藏結(jié)束后，采用熏蒸處理的葡萄，外觀沒有明顯可見的損害，沒有異味，色澤鮮亮。而對(duì)照的表面出現(xiàn)了達(dá)1/4面積的腐爛及褐色疤痕，腐爛指數(shù)達(dá)到了15%，葡萄顏色暗淡呈現(xiàn)褐色。顯然，熏蒸處理方式對(duì)葡萄的防腐保鮮效果顯著。

表4 蓼子樸精油熏蒸處理對(duì)葡萄自然腐爛的抑制效果Table 4 The rot rate of grape during storage after fumigation of essential oil from Inula salsoloides flowers

2.3 蓼子樸花精油抗菌成分分析

采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)從蓼子樸花中得到的萃取物為淡黃棕色的油狀物，得率在12.28%，m/m。從總萃取物中共鑒定了49種成分，主要包括小分子的有機(jī)酸和它的酯，小分子的芳香族化合物，單萜，倍半萜，二萜及烷基烴。有21種成分屬于精油組分，占總萃取物的83.66%，其中香草醛占有最高的比例，達(dá)到 30.35%（表 5）。香草醛是一種具有顯著抗菌活性的化合物[19]，分析認(rèn)為蓼子樸花精油在體內(nèi)體外所呈現(xiàn)出的抗菌活性與高含量的香草酚有直接的關(guān)系。與此同時(shí)，其它一些化合物也發(fā)揮了一定的協(xié)同作用，比如麝香草酚(3.51%)，該成分已被報(bào)道可以有效控制櫻桃的腐爛，并且被美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)認(rèn)為是對(duì)人體安全的防腐劑[20]。

趙堂[21]曾采用水蒸氣蒸餾法提取蓼子樸全草的精油，得到了20種成分，主要有2-壬酮(13.92%)、二乙醇縮乙醛(10.38%)、二乙二醇縮乙二醛(10.0%)、鄰丙酰基苯甲酸甲酯(10.08%)、肉豆蔻酸(8.03%)和鄰苯二甲酸二乙酯(7.38%)等，他的分析結(jié)果和我們的測定結(jié)果差異較大。分析認(rèn)為有兩種可能性，其一，不同的提取手段獲得的成分存在差異；其二，蓼子樸的不同部位所含的精油成分有差異，他研究的對(duì)象是蓼子樸的全草，我們主要提取的是蓼子樸的花。具體的原因，還有待進(jìn)一步的研究。

表5 蓼子樸花精油的化學(xué)成分Table 5 Chemical constituents of essential oil from Inula salsoloides flowers

7 8.38 1-甲基-3,3-二甲基-環(huán)丙烯 C6H10 3.26 8 9.10 甲基-4-己酸甲酯 C8H16O2 3.08 9 11.67 苯乙酸乙酯 C10H12O2 3.48 10 13.23 苯乙酸 C8H8O2 1.35 11 14.07 麝香草酚 C10H14O 3.51 12 17.37 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 C9H10O2 1.57 13 19.82 香草醛 C8H8O3 30.35 14 21.64 肉桂酸乙酯 C11H12O2 1.36 15 22.25 二氫獼猴桃（醇酸）內(nèi)酯 C11H16O2 1.86 16 24.29 δ-杜松萜烯 C15H24 1.44 17 26.46 橙花叔醇 C15H26O 1.35 18 26.77 （-）-石竹烯氧化物 C15H24O 2.56 19 27.16 chloromethyl 9-chloroundecanoate C12H22Cl2O2 11.72 20 28.27 丁香醛 C9H10O4 1.33 21 30.43 5H-Inden-5-one,1,2,3,3a,4,7a-hexahydro-7a-methyl-,trans- C10H14O 1.87

3 結(jié)論

利用超臨界萃取法從蓼子樸花中提取出的精油，具有綠色安全無毒的特性，對(duì)果蔬采后病害的三種常見菌（蘋果炭疽菌、番茄灰霉菌、馬鈴薯干腐菌）均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。通過熏蒸方式處理當(dāng)?shù)氐钠咸哑贩N紅提，防腐保鮮效果明顯，可有效延長果實(shí)的貯存期。這種處理方式不直接接觸水果，對(duì)水果的影響和損傷比較小，而且精油很容易揮發(fā)，不易在水果表面造成殘留，比較安全。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定出蓼子樸花精油的主要成分為香草醛，該成分已是應(yīng)用很廣泛的日用香料和食品添加劑之一。因此，可以直接利用蓼子樸花精油或進(jìn)一步通過分子蒸餾等手段來獲取香草醛等單體香料，為當(dāng)?shù)厥称饭I(yè)開發(fā)出綠色安全的食品防腐劑或殺菌劑。

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