肖志明，王峻，索德成，魏書(shū)林，賈錚，劉成新，樊霞

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的二氫吡啶

肖志明1，王峻2，索德成1，魏書(shū)林1，賈錚1，劉成新1，樊霞1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京），北京 100081；2湖北省獸藥監(jiān)察所，武漢 430070）

【目的】二氫吡啶是一種新型的飼料添加劑，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、改善肉質(zhì)等功效，目前已在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。然而，二氫吡啶并不是允許使用的藥物飼料添加劑，其在飼料中高水平添加所帶來(lái)的畜產(chǎn)品中二氫吡啶殘留可引起敏感人群嚴(yán)重的低血壓反應(yīng)。央視3.15晚會(huì)曝光了部分飼料企業(yè)違規(guī)使用二氫吡啶、硫酸黏桿菌素、喹乙醇等獸藥，引起社會(huì)的廣泛關(guān)注和政府的高度重視，因而亟需建立飼料中二氫吡啶的檢測(cè)方法，為飼料企業(yè)合理用藥和政府監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐?！痉椒ā坎捎肬PLC上常用的BEH C18色譜柱，分別使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相，優(yōu)化了不同組成和比例流動(dòng)相對(duì)色譜分離和質(zhì)譜電離的影響。在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描，確定準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化儀器毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、霧化氣流速等參數(shù)；然后進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量、駐留時(shí)間等參數(shù)，以確定豐度較高的兩個(gè)子離子作為定性離子，并選擇其中豐度最高的作為定量離子。比較甲醇、乙腈等不同溶劑對(duì)提取效率的影響，以及C18、HLB、MCX和堿性氧化鋁等固相萃取柱（SPE）對(duì)凈化效果的影響，確定較優(yōu)的樣品前處理方法?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化確定了較佳的前處理方法：采用乙腈超聲提取，提取液在60℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉靡译姗s水（1﹕9，v/v）復(fù)溶，過(guò)HLB固相萃取柱凈化，用乙腈﹕水（9﹕1，v/v）洗脫，洗脫液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）測(cè)定。采用電噴霧離子源，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，二氫吡啶的[M+H]+為254，失去乙氧基（CH3-CH2-O+，46 Da）后產(chǎn)生主要的碎片離子208，208脫掉羰基（C=O，28 Da）產(chǎn)生碎片離子180，180進(jìn)一步脫去乙酯基（CO-O-CH2-CH3，73 Da）后得到碎片離子108，因此本研究以離子對(duì)254＞208為定量離子，254＞180為定性離子。以0.1%的甲酸水-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在10 min內(nèi)完成了二氫吡啶的分離，且峰形尖銳，靈敏度高。二氫吡啶在0—500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R≥ 0.9992），根據(jù)20個(gè)空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ），二氫吡啶的LOD、LOQ分別為10和50 μg·kg-1。在10、50和100 μg·kg-1三個(gè)添加水平下，二氫吡啶的平均回收率為82.6%—101.0%，日內(nèi)變異系數(shù)為0.8%—6.7%，日間變異系數(shù)為4.7%—9.2%?！窘Y(jié)論】該方法操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定，適用于飼料中二氫吡啶的日常監(jiān)測(cè)。

超高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜；飼料；二氫吡啶

0 引言

【研究意義】二氫吡啶類(lèi)藥物屬于鈣通道阻滯劑類(lèi)（calcium channel blocker）降血壓藥，是能夠在通道水平上選擇性地阻滯鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的一類(lèi)具有廣泛心血管藥理作用的藥物，目前在醫(yī)學(xué)臨床上主要用于治療高血壓、心律失常、心絞痛、心力衰竭等心腦血管疾病[1-3]。20世紀(jì)70年代前蘇聯(lián)科學(xué)家KLUSA等發(fā)現(xiàn)二氫吡啶具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的作用，此后世界各國(guó)相繼展開(kāi)了相關(guān)研究[4-6]。需要注意的是，各大媒體及文獻(xiàn)資料中普遍使用的“二氫吡啶（diludine）”其化學(xué)名稱(chēng)實(shí)際為“2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氫吡啶（2,6-dimethyl-3,5-dicarboxy-1,4-dihydropyridine）”，本文研究的即為該物質(zhì)。由于其化學(xué)名稱(chēng)較為冗長(zhǎng)，因此媒體往往簡(jiǎn)稱(chēng)其為“二氫吡啶”，但二者其實(shí)是完全不同的兩種化學(xué)物質(zhì)（表1）。二氫吡啶的生理作用主要表現(xiàn)在抗氧化、促進(jìn)動(dòng)物消化吸收、調(diào)節(jié)動(dòng)物內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫力等方面[7-9]。目前，二氫吡啶已作為一種新型的飼料添加劑在畜牧生產(chǎn)中廣泛用于改善肉質(zhì)、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、提高家禽產(chǎn)蛋率、增強(qiáng)動(dòng)物繁殖性能、抗應(yīng)激等方面，還可用于防治奶牛乳房炎、脂肪肝等疾病[10-18]。此外，二氫吡啶能夠有效降低飼料中維生素A、維生素E、胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氧化損失，顯著提高其利用率[19-22]。然而，經(jīng)查詢(xún)“二氫吡啶”并未列入農(nóng)業(yè)部規(guī)定的允許使用物質(zhì)三大目錄——《飼料原料目錄》、《飼料添加劑品種目錄》和《藥物飼料添加劑品種目錄》，因此其在飼料中添加使用屬于違法行為。且二氫吡啶的添加濃度往往較高，如在育肥豬飼料中推薦添加量為50 mg·kg-1時(shí)可顯著促進(jìn)育肥豬的生長(zhǎng)發(fā)育，如此高水平的添加所帶來(lái)的畜產(chǎn)品中二氫吡啶殘留可能引起敏感人群嚴(yán)重的低血壓反應(yīng)。央視3.15晚會(huì)曝光了部分飼料企業(yè)違規(guī)使用二氫吡啶、硫酸黏桿菌素、喹乙醇等藥物，引起社會(huì)的廣泛關(guān)注和政府的高度重視，然而目前尚無(wú)二氫吡啶的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，難以對(duì)其進(jìn)行有效監(jiān)管?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于二氫吡啶的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。經(jīng)查詢(xún)僅金甌等[23]建立了二氫吡啶及其雜質(zhì)含量的高效液相色譜測(cè)定方法，以?xún)?yōu)化二氫吡啶的生產(chǎn)工藝。該方法僅可用于純品的檢測(cè)，并不適用于飼料等復(fù)雜基質(zhì)中二氫吡啶的測(cè)定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于飼料中二氫吡啶的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道，這在一定程度上制約了飼料企業(yè)合理使用藥物飼料添加劑，也限制了政府部門(mén)對(duì)其進(jìn)行有效監(jiān)管，尤其是在3.15晚會(huì)曝光之后，亟需飼料中二氫吡啶的檢測(cè)方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究旨在建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏測(cè)定飼料中二氫吡啶的UPLC-MS/MS方法，為飼料企業(yè)合理使用藥物飼料添加劑以及為政府監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年3—6月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）進(jìn)行。

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity超高效液相色譜儀-串聯(lián)XEVO TQ質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1工作站（美國(guó)Waters公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；氮吹儀（日本EYELA公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Milli-Q公司）；BS 210S 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；ZM 100旋風(fēng)磨（德國(guó)Retsch公司）；MS2 Minishaker旋渦振蕩器（德國(guó)IKA公司）；超聲波清洗儀（美國(guó)Crest公司）；臺(tái)式搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

表1 二氫吡啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-l,4-二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q制備的超純水；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3cc，美國(guó)Waters公司）；飼料樣品由國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱(chēng)取適量二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配置成濃度為1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃冰箱避光保存，有效期6個(gè)月；準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冰箱避光保存，有效期1個(gè)月。使用時(shí)用流動(dòng)相（0.1%甲酸-乙腈，90﹕10，v/v）逐級(jí)稀釋?zhuān)渲贸蓾舛葹?0—500 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

樣品提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)粉碎過(guò)40目篩（0.45 mm孔徑）的配合料、濃縮料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混料等飼料樣品2.0 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入乙腈20 mL，旋渦混勻30 s，置于超聲波水浴中超聲提取15 min。取出4℃下10 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液在氮吹儀上60℃下吹干，殘余物用3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）復(fù)溶，旋渦1 min使其充分溶解，備用。

凈化：HLB SPE柱預(yù)先用3 mL乙腈、3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）活化，取備用液過(guò)柱，用3 mL乙腈﹕水（1﹕9，v/v）淋洗，減壓抽干，用2 mL乙腈﹕水（9﹕1，v/v）洗脫，收集洗脫液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 儀器分析

色譜條件：Waters ACQUITY BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35℃；進(jìn)樣室溫度4℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.3 mL·min-1，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；脫溶劑氣為高純氮?dú)猓魉?00 L·h-1；碰撞氣為高純氬氣，流速0.13 mL·min-1，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。二氫吡啶的定量離子對(duì)為254＞208，錐孔電壓15 V，碰撞能量為10 eV；定性離子對(duì)為254＞180，錐孔電壓15 V，碰撞能量為15 eV，駐留時(shí)間（Dwell time）均為0.1 s。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白飼料樣品按照1.3所述方法進(jìn)行樣品提取和凈化，用洗脫液配制二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)曲線，使其濃度分別為0、10、20、50、100、500 μg·L-1，進(jìn)UPLC-MS/MS測(cè)定。以基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各飼料樣品的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表3，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明方法線性關(guān)系良好。

2.2 方法的選擇性、檢出限和定量限

隨機(jī)抽取不同來(lái)源的20份飼料樣品（包括豬配合料5份、雞配合料2份、魚(yú)配合料2份、豬濃縮料5份、牛精料補(bǔ)充料2份、羊精料補(bǔ)充料1份、添加劑預(yù)混料3份），按照1.3和1.4所述方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，代表性的空白及添加樣品色譜圖如圖1所示，在目標(biāo)化合物提取離子的保留時(shí)間內(nèi)沒(méi)有干擾峰的出現(xiàn)，表明該方法的選擇性良好。根據(jù)20個(gè)空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3為檢出限（limits of detection，LOD），S/N=10為定量限（limits of quantification，LOQ），二氫吡啶的LOD、LOQ分別為10和50 μg·kg-1（表3）。

2.3 準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性

選擇具有代表性的飼料樣品，包括豬配合料、豬濃縮料、牛精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混料進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，按照1.3和1.4所述方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，方法的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性見(jiàn)表4，代表性的空白和添加樣品色譜圖見(jiàn)圖1。由表4可知，對(duì)于飼料樣品，二氫吡啶的平均回收率在82.6%—101.0%之間，日內(nèi)變異系數(shù)在0.8%—6.7%之間，日間變異系數(shù)在4.7%—9.2%之間。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

表3 基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)

圖1 添加飼料樣品（A，50 μg·kg-1）及空白樣品（B）色譜圖

表4 飼料樣品添加二氫吡啶的回收率和變異系數(shù)

3 討論

3.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

本研究使用UPLC上常用的BEH C18色譜柱，分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相，考察不同組成和比例流動(dòng)相對(duì)色譜分離和質(zhì)譜電離的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相中添加甲酸后二氫吡啶的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高，甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響并不大，但采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)二氫吡啶的峰形更加尖銳。

質(zhì)譜條件優(yōu)化過(guò)程中，本研究首先采用濃度為1.0 μg·L-1的二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液上UPLC-MS/MS測(cè)定，在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描，確定準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化儀器毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、霧化器流速等參數(shù)。然后進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量、駐留時(shí)間等參數(shù)，確定豐度較高的兩個(gè)子離子作為定性離子，并選擇其中豐度最高的作為定量離子。

3.2 二氫吡啶的MS/MS裂解規(guī)律

二氫吡啶在正離子模式下的靈敏度最高，在ESI離子源電離后，獲得了質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子，即[M+H]+，準(zhǔn)分子離子在碰撞室發(fā)生裂解，圖2展示了二氫吡啶的主要碎片離子質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑。二氫吡啶的[M+H]+為254，失去乙氧基（CH3-CH2-O+，46 Da）后產(chǎn)生主要的的碎片離子208，208脫掉碳氧基（C=O，28 Da）產(chǎn)生碎片離子180，180進(jìn)一步脫去乙酯基（CO-O-CH2- CH3，73 Da）后得到碎片離子108。

圖2 二氫吡啶的子離子掃描色譜圖及可能的裂解途徑

3.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在藥物殘留分析中甲醇、乙腈是最為常用的提取溶劑，因此本研究首先對(duì)甲醇、乙腈的提取效果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示二者提取效率相當(dāng)，均能夠有效提取飼料中的二氫吡啶。但由于飼料樣品含有大量豆粕、玉米、棉粕、魚(yú)粉等蛋白質(zhì)原料，考慮到乙腈具有較好的沉淀蛋白效果，因此本研究最終使用乙腈作為提取溶劑。

飼料樣品基質(zhì)極其復(fù)雜，添加有大量蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等原料，選擇合適的凈化方式是確保檢測(cè)方法穩(wěn)定可靠的前提[24]。固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）是目前最為常用的凈化方法，與傳統(tǒng)液-液萃取相比，SPE具有凈化效果好、回收率高、重現(xiàn)性好、所需有機(jī)試劑少等優(yōu)點(diǎn)[25-27]。本研究比較了藥物檢測(cè)中常用的C18、HLB、MCX和堿性氧化鋁SPE柱，最終選擇了具有雙親性的Oasis HLB柱。HLB使用親水-親酯的共聚物作為填料，載樣量是普通C18的3倍左右，并且具有極好的重現(xiàn)性。一般的C18SPE柱在上樣和淋洗的過(guò)程中必須保持濕潤(rùn)，不能干涸，否則柱填料容易出現(xiàn)細(xì)微的不易察覺(jué)的裂痕，會(huì)嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的回收率和重現(xiàn)性，而Oasis HLB柱的雙親性共聚物填料克服了這個(gè)問(wèn)題，使用起來(lái)更為方便[28]。

本研究首先采用Waters推薦的處理方法，即用乙腈/水（5﹕95，v/v）為上樣液，100%乙腈為洗脫液。采用此法基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重，UPLC-MS/MS質(zhì)量離子色譜圖上出現(xiàn)了雜質(zhì)干擾峰。為了排除基質(zhì)干擾，本法在推薦方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)二氫吡啶在HLB柱上的洗脫曲線進(jìn)行了研究。取空白樣品按照1.3進(jìn)行提取，提取液加入適量二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后加入到經(jīng)過(guò)活化的HLB柱上，待自然流干后用純水淋洗，分別以10%—100%乙腈/水溶液洗脫并收集，將所得的洗脫液過(guò)有機(jī)濾膜后進(jìn)UPLC-MS/MS分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制洗脫曲線（圖3）。從圖3可以看出，二氫吡啶在HLB SPE柱上具有較好的保留，只有在乙腈的比例達(dá)到80%以上時(shí)才能獲得較為理想的回收率。因此，本研究選擇90%乙腈/水作為洗脫溶液，以盡可能減少雜質(zhì)的共洗脫，從而降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)靈敏度的影響。

圖3 二氫吡啶在HLB柱上的洗脫曲線

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS聯(lián)用ESI接口最常見(jiàn)的問(wèn)題，基質(zhì)效應(yīng)以離子抑制現(xiàn)象居多，離子增強(qiáng)則較為少見(jiàn)。樣品前處理難以把基質(zhì)完全去除，因而在上機(jī)液中往往還存在大量的雜質(zhì)，且其含量要遠(yuǎn)大于目標(biāo)化合物的量。在ESI電離時(shí)，這些雜質(zhì)與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電荷，使得目標(biāo)物不能完全電離，甚至被基質(zhì)所淹沒(méi)而完全沒(méi)有信號(hào)，導(dǎo)致提取液中目標(biāo)物的響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比明顯降低，從而影響方法的定量。降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果影響的方法有內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)添加法、基質(zhì)添加法等[29-31]，其中標(biāo)準(zhǔn)添加法操作繁瑣，應(yīng)用較少。通過(guò)比較二氫吡啶在UPLC-MS/MS上的相對(duì)響應(yīng)值（基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液值/標(biāo)準(zhǔn)溶液值）可以看出，相對(duì)響應(yīng)值約為80%左右，說(shuō)明離子抑制現(xiàn)象的存在。由于缺乏商品化的氘代內(nèi)標(biāo)，本研究采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量以彌補(bǔ)離子抑制造成的損失。

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)收集的18份飼料樣品（仔豬配合料2份、育肥豬配合料3份、魚(yú)配合料3份、豬濃縮料5份、牛精料補(bǔ)充料2份、羊精料補(bǔ)充料1份、添加劑預(yù)混料3份）進(jìn)行了檢測(cè)，所有樣品中均未檢出二氫吡啶。為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，對(duì)該18份飼料樣品進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)，添加二氫吡啶的濃度均為100 μg·kg-1，檢測(cè)結(jié)果在87.5—99.8 μg·kg-1之間，平均回收率為92.6%。

4 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定飼料中二氫吡啶的分析方法，該方法在0—500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，二氫吡啶的檢出限為10 μg·kg-1，定量限為50 μg·kg-1，3個(gè)添加水平下的平均回收率為82.6%—101.0%，日內(nèi)變異系數(shù)小于6.7%，日間變異系數(shù)小于9.2%。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定，適用于飼料中二氫吡啶的測(cè)定。

[1] RUCINS M, KALDRE D, PAJUSTE K, FERNANDES M A S, VICENTE J A F, KLIMAVICIUSA L, JASCHENKO E, KANEPE-LAPSA I, SHESTAKOVA I, PLOTNIECE M, GOSTEVA M, SOBOLEV A, JANSONE B, MUCENIECE R, KLUSA V, PLOTNIECE A. Synthesis and studies of calcium channel blocking and antioxidant activities of novel 4-pyridinium and/or N-propargyl substituted 1,4-dihydropyridine derivatives., 2014, 17: 69-80.

[2] 蔡菁菁, 黃志軍, 袁洪. 二氫吡啶類(lèi)鈣通道受體拮抗劑代謝及受體相關(guān)基因的研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010, 16(24): 3705-3707.

CAI J J, HUANG Z J, YUAN H. Research progress in metabolism and receptor gene of dihydropyridines calcium channel antagotfists., 2010, 16(24): 3705-3707. (in Chinese)

[3] 董健玉, 李士通, 汪正平, 邱郁薇. 高血壓患者長(zhǎng)期口服二氫吡啶類(lèi)藥物對(duì)維庫(kù)溴銨肌松效應(yīng)的影響. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2007, 23(6): 457-459.

DONG J Y, LI S T, WANG Z P, QIU Y W. Effects of long-term taking dihydropyridines on neuromuscular blockade of vecurolium in patients with hypertension., 2007, 23(6): 457-459. (in Chinese)

[4] KLUSA V. Atypical 1,4-dihydropyridine derivatives, an approach to neuroprotection and memory enhancement., 2016, 113: 754-759.

[5] 鄒曉庭, 王友明, 盧建軍. 二氫吡啶（diludin）抗蛋雞脂肪肝的機(jī)理. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2002, 22(6): 620-623.

ZOU X T, WANG Y M, LU J J. Effects of diludine on prevention from fatty liver of laying hens and its mechanism., 2002, 22(6): 620-623. (in Chinese)

[6] JANSONE B, KADISH I, GROEN T, BEITNERE U, MOORE D R, PLOTNIECE A, PAJUSTE K, KLUSA V. A novel 1, 4-dihydropyridine derivative improves spatial learning and memory and modifies brain protein expression in wild type and transgenic APPSweDImice., 2015, 10(6): 1-15.

[7] 鄒曉庭, 朱金孌, 許梓榮. 二氫吡啶對(duì)產(chǎn)蛋雞脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)的影響. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 25(3): 323-325.

ZOU X T, ZHU J L, XU Z R. Effects of 1,4-dihydropyridine (DHP) on fatty transportation in laying hens., 2005, 25(3): 323-325. (in Chinese)

[8] 李玉榮, 武現(xiàn)軍, 霍書(shū)英, 郝延剛, 龐新位. 二氫吡啶對(duì)尼羅羅非魚(yú)生產(chǎn)性能及機(jī)體抗氧化性能的影響. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 26(3): 11-14.

LI Y R, WU X J, HUO S Y, HAO Y G, PANG X W. Effects of diludin on the growth performance and the antioxidant activity of., 2003, 26(3): 11-14. (in Chinese)

[9] 武現(xiàn)軍, 李成會(huì), 龐新位, 張香齋. 二氫吡啶對(duì)雛雞免疫功能的影響. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2000, 20(4): 386-389.

WU X J, LI C H, PANG X W, ZHANG X Z. Effects of diludin on immunologic competence of chicks., 2000, 20(4): 386-389. (in Chinese)

[10] 鄒曉庭, 朱金孌, 許梓榮. 二氫吡啶預(yù)防蛋雞脂肪肝的效果研究. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 29(6): 655-660.

ZOU X T, ZHU J L, XU Z R. Effects of dietary 1,4-dihydropyridine on fatty liver of laying hens., 2003, 29(6): 655-660. (in Chinese)

[11] NIU Z Y, MIN Y N, WANG H Y, ZHANG J, LI W C, LI L, LIU F Z．Effects of dietary dihydropyridine on laying performance and lipid metabolism of broiler breeder hens．, 2011, 41: 331-336.

[12] HISAR O, YANIK T, KOCAMAN E M, ARSLAN M, SLUKVIN A, GONCHAROVA R. Effects of diludine supplementation on growth performance, liver antioxidant enzyme activities and muscular trace elements of rainbow trout () juveniles at a low water temperature., 2012, 18: 211-219.

[13] 張香齋, 張文香, 李成會(huì), 武現(xiàn)軍, 龐新位. 二氫吡啶對(duì)育成雞生長(zhǎng)發(fā)育的影響. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 28(3): 84-87.

ZHANG X Z, ZHANG W X, LI C H, WU X J, PANG X W. Effects of diludin on the growth and development of chicks., 2005, 28(3): 84-87. (in Chinese)

[14] NIU Z Y, LIU F Z, MIN Y N, LI W C. Effects of dietary dihydropyridine supplementation on growth performance and lipid metabolism of broiler chickens., 2013, 55(3): 116-122.

[15] 房祥軍. 二氫吡啶和納米二氫吡啶對(duì)產(chǎn)蛋雞脂肪代謝的影響及其作用機(jī)理研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2006.

FANG X J. Effects of 1,4-diludin and nano-1,4-diludin on fat metabolism of laying hens and approach to the mechanism[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2006. (in Chinese)

[16] 葉紅, 胡忠澤. 二氫吡啶對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能及對(duì)尿素氮、甲狀腺激素的影響. 糧食與飼料工業(yè), 2004, 4: 35-37.

YE H, HU Z Z. Effects of diludine on the production performance of broilers and on BUN and thyroxine., 2004, 4: 35-37. (in Chinese)

[17] 李成會(huì), 朱蓮英, 龐新位. 二氫吡啶對(duì)生長(zhǎng)階段豬生長(zhǎng)性能的影響研究. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2007, 34(4): 22-24.

LI C H, ZHU L Y, PANG X W. The effect of diludin on the growth performance of growing-period pig growth., 2007, 34(4): 22-24. (in Chinese)

[18] 江鳳霞. 二氫吡啶對(duì)肉鴨生產(chǎn)性能的影響及殘留消除規(guī)律研究[M]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

JIANG F X. Effects of dihydropridine on growth performance and residue and clearance in duck[M]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[19] 李廣, 周占琴, 武和平, 付明哲. 二氫吡啶與VE對(duì)布爾山羊精液品質(zhì)的影響. 畜牧獸醫(yī)科學(xué), 2004, 20(1): 110-118.

LI G, ZHOU Z Q, WU H P, FU M Z. Effects of dilludine and vitamin E on semen vitality from Boer Goats., 2004, 20(1): 110-118. (in Chinese)

[20] 張峰, 吳占軍, 張新同, 王昆, 王學(xué)清, 馬書(shū)林, 劉小虎. 二氫吡啶對(duì)熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶量以及奶牛體溫、呼吸頻率的影響. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 25: 270-273.

ZHANG F, WU Z J, ZHANG X T, WANG K, WANG X Q, MA S L, LIU X H. Effects of 1,4-dihydropyridine on milk yield, body temperature and respiration of lactating dairy cows in heat stress., 2010, 25: 270-273. (in Chinese)

[21] BRUVERE I, BISENIEKS E, POIKANS J, ULDRIKIS J, PLOTNIECE A, PAJUSTE K, RUCINS M, VIGANTE B, KALME Z, GOSTEVA M, DOMRACHEVA I, VELENA A, VUKOVIC T, MILKOVIC L, DUBURS G, ZARKOVIC N. Dihydropyridine derivatives as cell growth modulators, 2017(2): 1-15.

[22] 余祖功, 夏德全, 吳婷婷. 鹽酸半胱胺和二氫吡啶對(duì)奧利亞羅非魚(yú)生長(zhǎng)及相關(guān)激素水平、血液生化指標(biāo)的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 28(4): 96-99.

YU Z G, XIA D Q, WU T T. Effects of cysteamine hydrochloride and diludin on growth, hormone and physio-biochemical parameters levels in., 2005, 28(4): 96-99. (in Chinese)

[23] 金甌, 鄭之詹, 郭慧. HPLC法測(cè)定二氫吡啶的含量. 飼料研究, 2007, 12(7): 24-25.

JIN O, ZHENG Z Z, GUO H. Determination of diludine by high performance liquid chromatography., 2007, 12(7): 24-25. (in Chinese)

[24] XIAO Z M, LI S, GUO J P, RAO Z H, LIU C X, JIA Z, SUO D C, WANG S, LI Y, FAN X. Application of enzymatic probe sonication for selenium speciation in animal feeds., 2017, 1530: 51-58.

[25] 平華, 李楊, 李冰茹, 何昭穎, 劉繼培, 馬智宏. 基于分散固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中多種除草劑殘留的方法. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(21): 4159-4169.

PING H, LI Y, LI B R, HE Z Y, LIU J P, MA Z H. Simultaneous determination of multi herbicides residues in vegetables by dispersive solid phase extraction and ultra-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry., 2017, 50(21): 4159-4169. (in Chinese)

[26] 程劼, 蘇曉鷗, 張維, 王瑞國(guó), 王培龍, 李陽(yáng). 氣相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定餐廚廢棄物中的丙烯酰胺. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(16): 3373-3381.

CHENG J, SU X O, WANG R G, WANG P L, LI Y. Determination of acrylamide in kitchen waste using gas chromatography-tandem mass spectrometry., 2012, 45(16): 3373-3381. (in Chinese)

[27] XIAO Z M, LI X W, WANG X L, SHEN J Z, DING S Y. Determination of neonicotinoid insecticides residues in bovine tissues by pressurized solvent extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry., 2011, 879: 117-122.

[28] XIAO Z M, YANG Y X, LI Y, FAN X, DING S Y. Determination of neonicotinoid insecticides residues in eels using subcritical water extraction and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry., 2013, 77: 32-40.

[29] 李帥鵬, 黃顯會(huì), 楊剛, 郭春娜. 動(dòng)物可食性組織中克拉維酸殘留HPLC-MS/MS檢測(cè)方法. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(23): 5012-5019.

LI S P, HUANG X H, YANG G, GUO C N. Determination of clavulanic acid residue in edible tissues of animals by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry., 2013, 46(23): 5012-5019. (in Chinese)

[30] XIAO Z M, SONG R, RAO Z H, WEI S L, JIA Z, SUO D C, FAN X. Development of a subcritical water extraction approach for trace analysis of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol, and florfenicol amine in poultry tissues., 2015, 1418: 29-35.

[31] 陳小軍, 王萌, 范淑琴, 崔海榮, 楊益眾. QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-MS/MS法分析氯蟲(chóng)苯甲酰胺在甘藍(lán)和土壤中的殘留. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2636-2647.

CHEN X J, WANG M, FAN S Q, CUI H R, YANG Y Z. Degradation dynamics and residues analysis of chlorantraniliprole in cabbage and soil by QuEChERS- high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry., 2012, 45(13): 2636-2647. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Quantitative Determination of Diludine in Animal Feeds by Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

XIAO ZhiMing1, WANG Jun2, SUO DeCheng1, WEI ShuLin1, JIA Zheng1, LIU ChengXin1, FAN Xia1

(1China National Feed Quality Control Center, Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Hubei Veterinary Drugs Inspection Department，Wuhan 430070)

【Objective】As a new kind of feed additive, diludine has been widely used in livestock production because it can promote the growth of animals, increase efficiency of the feed, and improve the meat quality. However, diludine is not allowed to use as a medical feed additive. The residues of diludine in animal origin foods may cause severe hypotensive reaction in the sensitive population. In the past World Consumer Rights Day, also known as 3.15, the national broadcaster China Central Television (CCTV) exposed parts of illegal use of veterinary drugs (e.g. diludine) in some of the feed companies, which draw extensive concerns of the society and the government. It is, therefore, of great importance to develop sensitive and reliable analytical methods to monitor diludine in feedstuffs in order to protect consumer rights and to provide technical support for government regulation.【Method】Chromatographic separation was achieved using a BEH C18column, and different mobile phases consisting of methanol-water, acetonitrile-water, methanol-0.1% formic acid, and acetonitrile-0.1% formic acid at different concentrations were optimized. In order to achieve the maximum sensitivity of ESI-MS/MS, direct infusion of standard solution was carried out in positive ionization mode to optimize the ESI source parameters (e.g. capillary voltage, cone voltage, and desolvation gas flow rate). Then dissociation with argon was induced and different collision energies and dwell times were compared in order to find the daughter ions, and the most abundant product ion was used as the quantification ion. In order to find the best sample preparation method, different extraction solvent (methanol and acetonitrile) and solid phase extraction (SPE) cartridges (C18, HLB, MCX and alumina B) were optimized. 【Result】The optimized sample preparation procedures were conditioned as follows: Feed samples were extracted using acetonitrile and the supernatants were evaporated to dryness under a gentle stream of nitrogen at 60℃. The residues were re-dissolved with acetonitrile/water (1:9), and then cleaned up on HLB SPE cartridges. The target compounds were identified and quantitatively determined by ultra-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization (ESI) tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) operated in multiple reaction monitoring mode (MRM). The molecular ion [M+H]+ of diludine is254, and the loss of –OCH2CH3(46 Da) is found to be common and leads to the major daughter ion208. The elimination of –CO (28 Da) from the ion208 gives the fragment at180, and then a subsequent loss of –COOCH2CH3(73 Da) leads to the fragment at108. Therefore, in this study, the quantitative ion was254＞208, while254＞180 was used for qualitative ion. Under the current optimized chromatographic conditions, each LC run was completed in 10 min. Good linearity was obtained in the ranges of 0-500 μg·L-1, with linear coefficients (R) higher than 0.9992. The limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) which defined as the concentration with a signal-to-noise ratio (S/N) of 3 and 10, were 10 μg·kg-1and 50 μg·kg-1, respectively. Average recoveries from three fortification levels (10, 50 and 100 μg·kg-1) ranged between 82.6% and 101.0%, with relative standard deviations (RSD) lower than 9.2%. 【Conclusion】The proposed method is fast, sensitive, and easy to perform, making it applicable for high-throughput daily monitoring.

ultra-performance liquid chromatography; tandem mass spectrometry; animal feeds; diludine

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.017

2017-08-01；

2018-02-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502116）、“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目課題（2016YFF0201802）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院“飼料質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

肖志明，E-mail：xiaozhiming@caas.cn。

樊霞，E-mail：fanxia@caas.cn