陶永萍 尹躍艷 陳旭 盧訓 李婷婷 趙聲春 游堂貴 丁銘

摘要 煙草脈斑病在云南昭通市的煙草上發(fā)生危害嚴重，為明確昭通市煙草脈斑病的病毒種類，本研究采集昭通市的4個煙草種植區(qū)癥狀表現為疑似煙草脈斑病的煙草樣品，采用小RNA深度測序技術對不同來源的混合樣品進行小RNA測序分析。結果顯示混合樣品中的病毒分別屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus、馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus和馬鈴薯卷葉病毒屬Polerovirus。根據不同病毒屬設計通用引物，分別對不同地區(qū)的煙草樣品進行RT-PCR驗證，結果表明，煙草樣品中病毒種類有煙草花葉病毒、煙草脈帶花葉病毒、煙草脈扭病毒和馬鈴薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。

關鍵詞 煙草脈斑病； 煙草病毒； 小RNA深度測序

中圖分類號： S 432.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017211

Abstract Flue-cured tobacco vein spot disease causes severe damage to tobacco production in Zhaotong City， Yunnan Province of China. In this study， siRNA deep sequencing was used to analyze the viruses in tobacco samples with necrotic and mosaic symptoms on tobacco leaves. The samples were collected from four different areas in Zhaotong City and mixed into one sample for siRNA sequencing analysis. The results showed that the identified viruses belonged to three genera， including Tobamovirus， Potyvirus and Polerovirus. RT-PCR and sequencing were used to identify the species of the viruses. Four viruses were detected in the samples， including TMV， TVBMV， TVDV and three strains of PVY （PVYN， PVYN-Wi， PVYNTN）.

Key words tobacco vein spot disease； tobacco virus； siRNA sequencing

煙草是云南省的重要農業(yè)產業(yè)，在全省范圍內常年種植面積保持在35萬hm2左右。由于煙草病毒病害常年發(fā)生，加之寄主植物和傳毒介體周年分布，導致了病毒病原大量積累，煙草病毒病發(fā)生危害日益嚴重。煙草脈斑病在云南昭通煙區(qū)發(fā)生危害較為普遍，該病自2007年在昭通市小面積發(fā)生，2008年發(fā)病面積及危害程度大幅增加，目前已成為影響該地區(qū)煙草生產最重要的病害之一。煙草脈斑病最早在山東、遼寧、安徽北部和河南西部等地發(fā)生危害嚴重，發(fā)病率高達 50%～80%，部分田塊甚至絕收[14]。該病主要由馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）侵染引起，常與黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）、煙草蝕紋病毒Tobacco etch virus（TEV）、煙草脈斑駁病毒Tobacco vein mottle virus（TVMV） 、煙草壞死病毒Tobacco necrosis virus（TNV）等病毒中的1個或多個復合侵染煙株[5]。由于該病主要由PVY引起，其癥狀與病毒種類具有密切的關系，根據侵染煙草的PVY株系可大致將癥狀分為花葉、脈壞死、條斑及莖壞死[1]。

通過前期調查發(fā)現，煙草脈斑病樣品中存在多種病毒復合侵染的現象，且在不同地區(qū)的復合侵染類型不同，采用傳統的血清學、PCR等方法對癥狀表現明顯的煙草病毒病原進行鑒定不能完整地反映樣品中的病毒種類，尤其不能檢測到可能存在的不同病毒病原。利用基于小RNA深度測序的病毒鑒定技術，不僅能檢測到寄主中不同病毒病原，同時具有更高的靈敏度和信噪比。因此本研究在昭通煙區(qū)4個不同煙草脈斑病重病區(qū)采集典型癥狀樣品，采用小RNA深度測序技術對煙草脈斑病病樣進行檢測和分析，為病害的防控提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草樣品采自云南省昭通市蘇家院、布嘎、北閘、守望等4個病毒病發(fā)生較重的煙區(qū)，樣品癥狀主要表現為脈壞死、植株矮化、葉片壞死斑點并伴隨有頂部花葉癥狀，同時提取不同采集地點的煙草樣品RNA用于測序結果的驗證分析。

1.2 方法

1.2.1 小RNA測序與分析

將4個地點采集的煙草樣品按相同質量比例進行混合，混合樣品送于華大基因公司進行小RNA測序分析。提取樣品總RNA，測定總RNA的濃度及純度，將質量合格的RNA樣品使用NEB針對Illumina測序平臺研發(fā)的Small RNA建庫試劑盒（NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina）及配套的試劑進行小RNA文庫構建。文庫構建完成后，使用Agilent2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，使用Qubit2.0和熒光定量PCR對文庫的濃度進行定量，以保證文庫質量。對檢測合格的小RNA文庫在Hiseq 2000測序平臺進行測序。使用CLC Genomics Workbench 5軟件對獲得的小RNA序列數據進行組裝和比對分析。

1.2.2 小RNA測序結果驗證

根據小RNA測序結果與GenBank中序列比對分析結果，設計合成用于檢測煙草脈帶花葉病毒Tobacco vein banding mosaic virus（TVBMV）的特異性引物TVBMV-8059F/TVBMV-9382R。根據文獻報道分別合成用于擴增煙草花葉病毒屬Tobamovirus[6]和馬鈴薯卷葉病毒屬Polerovirus[7]的通用引物，以及辣椒環(huán)斑病毒Chilli ringspot virus（ChiRSV）特異性引物[8]，以及用于鑒定PVY不同株系的引物對小RNA測序結果進行驗證[9]（表1）。

采用Promega公司的Access RT-PCR System 一步法試劑盒進行反轉錄和PCR擴增，反應體系為50 μL，其中AMV/Tfl 5×Reaction Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游和下游引物各5 μL，25 mmol/L MgSO4 2 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL，總RNA 1 μg，補加RNA free水至50 μL。反應條件為45℃反轉錄45 min；94℃預變性2 min；94℃變性30 s，根據不同引物設定退火溫度1 min，68℃延伸2 min，40個循環(huán)；68℃延伸7 min。將RT-PCR擴增產物回收并克隆到pEGM-T easy載體上，篩選陽性克隆進行測序。利用DNAMAN Version 7.0進行序列拼接及分析。進化樹構建采用了MEGA 6.0軟件[10]，以NJ（neighbor-joining）方法構建，進化樹各分支的可信度用Bootstrap檢測（1 000次重復）。

2 結果與分析

2.1 小RNA測序結果

測序結果顯示樣品中小RNA序列有35 094 242條，分別與GenBank中報道的序列進行對比，結果表明得到的小RNA序列與13種植物病毒核苷酸相似性較高，在93%～100%之間。這13種植物病毒分屬煙草花葉病毒屬Tobamovirus、馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus和馬鈴薯卷葉病毒屬Polerovirus，煙草花葉病毒屬包括煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus （TMV）、番茄花葉病毒Tomato mosaic virus （ToMV）、辣椒輕斑駁病毒Pepper mild mottle virus （PMMV）、地黃花葉病毒Rehmannia mosaic virus （ReMV）；馬鈴薯Y病毒屬包括馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、煙草脈帶花葉病毒Tobacco vein banding mosaic virus （TVBMV）、辣椒環(huán)斑病毒Chilli ringspot virus（ChiRSV），其中PVY還有PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi 4個株系；黃癥病毒科的馬鈴薯卷葉病毒屬包括甜菜輕型黃化病毒Beet mild yellowing virus （BMYV）、甜菜黃萎病毒Beet chlorosis virus （BChV）、甜菜西黃病毒Beet western yellows virus （BWYV）、蕓薹屬植物黃化病毒Brassica yellows virus （BrYV）、蕪菁黃化病毒Turnip yellows virus （TuYV）、煙草脈扭病毒Tobacco vein distorting virus （TVDV）（表2）。

2.2 煙草花葉病毒屬病毒驗證

根據張永江等[6]的報道，應用引物Tobamo6F6和Tobamo6R6對樣品進行PT-PCR擴增，得到約0.25 kb大小的目的條帶（圖1a），回收目的條帶進行克隆，挑取5個克隆進行測序分析。測序結果表明擴增片段大小為0.2 kb，經Blast比對分析與TMV核苷酸序列相似性最高，與已報道的四川徐永分離物（No.HE818454）相似性為100%。構建該序列與TMV不同病毒分離物的系統進化樹，結果顯示昭通煙草上TMV與四川敘永分離物（No.HE818454）關系最近，與云南魯甸分離物關系次之（圖2a）。結果表明，小RNA深度測序檢測到的煙草花葉病毒屬病毒為TMV。用于構建系統進化樹的序列來自GenBank，序列號分別為：TMV煙草分離物（No.HE818435， HE818454），ToMV番茄分離物（No.FN985165），ToMV人參果分離物（No.KJ207374），辣椒輕斑駁病毒益母草分離物（No.KR108207），辣椒輕斑駁病毒甜椒分離物（No.KP345899），地黃花葉病毒地黃分離物（No.EF375551， JX575184）。

2.3 馬鈴薯Y病毒屬病毒驗證

用TVBMV特異性引物（TVBMV-9382R/TVBMV-8059F）和ChiRSV特異性引物（ChiRSV1f/ChiRSV 1r）驗證樣品中是否帶有TVBMV和ChiRSV。結果顯示，前者擴增得到約1.2 kb的目的條帶，而后者未擴增到目的條帶（圖1b、c）?；厥赵撃康钠芜M行克隆和測序，測序結果表明目的片段大小為1.324 kb，與TVBMV YN9.1分離物（No.KF444434）的核苷酸相似性為99%。結果表明小RNA測序結果中的馬鈴薯Y病毒屬病毒為TVBMV。

2.4 馬鈴薯Y病毒不同株系驗證

根據Rigotti和Gugerli[9]的報道，應用3對引物PVYc3/PVYf，PVY3+/PVY3-，CP2+/CP1-，嚴格按照報道中所述的引物濃度比例，采用Access RT-PCR System反應條件及體系進行反轉錄和PCR擴增，分別得到約1.1、0.51 kb及0.48 kb的條帶（圖1e），回收各條帶進行克隆和測序。測序結果顯示，片段大小為1.114 kb的目的條帶與已報道的新西蘭分離物（No.AM268435）相似性為98%，為PVYN株系的部分序列。片段大小為0.532 kb的目的片段與已報道的南非TT138E-102-96分離物（No.GQ853641）序列相似性為99%，為PVYN-Wi株系的外殼蛋白堿基序列。片段大小為0.438 kb的目的條帶與已報道的中國HN2分離物（No.GQ200836）相似性為99%，為馬鈴薯Y病毒全基因的部分序列。根據Hu[7]等對HN2分離物的報道，HN2分離物占有PVYO血清型，致病型表現多樣，在煙草上表現為PVYN，在馬鈴薯上表現為PVYNTN型。

根據報道，引物CP2+/CP1-特異性檢測PVYN-Wi株系，因此判斷供試樣品中存在PVYN-Wi株系。引物PVYc3和PVYf檢測PVYN、PVYNTN、PVYO及PVYC 株系， PVYO和PVYC應擴增出0.66 kb片段，PVYN和PVYNTN應擴增出0.44 kb片段，結合株系驗證結果，供試樣品擴增出的條帶大小為0.438 bp，表明為重組PVYNTN 株系，因此判斷供試樣品中存在重組PVYNTN株系，沒有PVYO和PVYC 株系。引物PVY3+和PVY3-能檢測PVYN和非重組PVYNTN株系，結合株系驗證結果，供試樣品擴增出的條帶大小為1.114 kb，表明為重組PVYN 株系，因此判斷供試樣品中存在重組PVYN株系。綜上所述，供試樣品中存在PVYN-Wi、重組PVYNTN和PVYN 株系。

2.5 馬鈴薯卷葉病毒屬病毒驗證

用黃癥病毒科通用引物Lu1和Lu4[7]，進行反轉錄和PCR擴增，在約0.8、0.7 kb和0.650 kb處各有一條明顯的條帶（圖1d），回收各條帶進行克隆和測序。測序結果表明0.8 kb條帶為煙草線粒體基因組DNA堿基序列；0.7 kb條帶為TVDV 核苷酸序列，具體為0.572 kb，與已報道的云南龍陵分離物（No.EF529624）序列相似性為100%；0.65 kb條帶也為TVDV 核苷酸序列，具體為0.54 kb，與已報道的云南保山分離物（No.AF402621）序列相似性為99%，結果顯示煙草樣品中的馬鈴薯卷葉病毒屬病毒是TVDV。用0.572 kb條帶和0.54 kb條帶序列與GenBank中的相關序列構建進化樹（見圖1b），與云南的所有分離物都聚在一起。用于構建系統進化樹的序列來自GenBank，病毒名稱及序列號分別為：BMYV（No.EF107543），BChV（No.EU022510），BWYV（No.X13062），BrYV（No.KP178197），TuYV（No.KR706247）TVDV（No.EF529624，KP772232，KP772233）。

3 討論

云南地處我國西南邊陲，西部與緬甸唇齒相依，南部和東南部分別與老撾、越南接壤。該區(qū)域地處低緯高原，地理位置特殊，地形地貌復雜。全省氣候類型豐富多樣，有熱帶、亞熱帶、中溫帶和高原氣候類型，其氣候類型的多樣化，造就了繁多的生物種類。云南煙草病毒種類多樣，目前已報道的病毒種類多達30多種，其中TMV[11]、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）[12]、TVBMV[13]、番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus （TSWV）[14]、雙生病毒begomoviruses[15]、PVY[16]、煙草叢頂病毒Tobacco bushy top virus （TBTV）[17]是長期、多區(qū)域危害云南省煙草并造成重大損失的病毒病原。

2007-2017年對昭通煙區(qū)煙草病害調查及病原檢測研究表明，云南昭通地區(qū)煙草受馬鈴薯Y病毒屬病毒的危害嚴重，發(fā)病率在3%～10%之間，重病區(qū)發(fā)病率可以達到100%，嚴重影響了該地區(qū)煙草產量和質量。前期對該病害病原的鑒定采用的是傳統的血清學檢測及RT-PCR鑒定的方法，因此大部分研究結果僅局限在potyviruses的研究[5，17]。本研究的小RNA深度測序結果表明煙草樣品中小RNA序列與13種植物病毒相似性較高（93%～100%），這13種植物病毒分別屬于煙草花葉病毒屬、馬鈴薯Y病毒屬和馬鈴薯卷葉病毒屬等3個病毒屬。煙草花葉病毒屬包括TMV、ToMV、PMMV、ReMV；馬鈴薯Y病毒屬包括PVY、TVBMV、ChiRSV，其中PVY還有PVYO、PVYN、PVYNTN、PVYN-Wi 4個株系；馬鈴薯卷葉病毒屬包括BMYV、BChV、BWYV、BrYV、TuYV、TVDV。由于小RNA測序所得序列較短，在GenBank中進行序列對比時，如果某一段病毒序列是該病毒所在屬內病毒的保守序列，就可能將同屬不同種病毒都作為結果統計出來，而實際上樣品中沒有那么多病毒。因此我們用RT-PCR對4個屬的13種病毒進行驗證，且對PVY 株系也進行了驗證。結果證明昭通煙區(qū)癥狀表現為脈壞死、植株矮化、葉片壞死斑點并伴隨有頂部花葉癥狀煙草樣品中病毒種類有4種，分別為TMV、TVDV、TVBMV和PVY，其中PVY包含不同株系，分別是PVYN-Wi、重組PVYNTN和PVYN 株系。根據前期研究結果，昭通煙區(qū)煙草脈斑病的主要病毒為PVY，且有不同株系的PVY復合侵染煙草，本結果與前期檢測結果相同[17]。

TVDV是引起煙草叢頂病的兩種病毒之一，在發(fā)病煙草中多與煙草斑駁病毒Tobacco mottle virus （TBMV）復合侵染煙草引起煙草叢枝病，自然條件及人工接種都很難得到單獨感染TVDV的煙草植株[18]。本研究通過小RNA深度測序檢測到昭通煙草脈斑病樣品中有TVDV的侵染，但未檢測到TBMV，且發(fā)病煙草田塊中也未發(fā)現有疑似叢頂病癥狀的煙草，這是云南首次報道TVDV與其他病毒復合侵染煙草，而對于TVDV在煙草脈斑病病害流行過程中扮演的角色還有待進一步研究。

TVBMV為馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus病毒。2004-2006年Tian對中國四大煙草主產區(qū)的煙草病毒病進行調查，首次發(fā)現云南煙草中TVBMV的存在[19]。前期研究也發(fā)現TVBMV是煙草脈斑病的主要病毒之一，本研究中小RNA深度測序結果也證明了TVBMV是該煙區(qū)的優(yōu)勢病毒。

本研究中報道的4種病毒，除TMV以外均為蚜蟲傳播的病毒。在昭通煙區(qū)，煙草通常與馬鈴薯、辣椒種植田塊相鄰，在日常施用化學殺蟲劑進行蚜蟲防治時，防蟲效果不理想，主要原因在于不同作物間不能統防統治，加之該地區(qū)馬鈴薯種薯質量參差不齊，因此該地區(qū)煙草脈斑病發(fā)病率和危害程度持續(xù)較高，病害防控效果不顯著。針對以上情況，對該區(qū)域蚜蟲病毒病害的防控要從“大農業(yè)”角度，實行統防統治；種植優(yōu)質無毒種薯；以治蟲防病為主，建立一個健康、少毒源的環(huán)境才能有效控制病害的持續(xù)危害。同時加強對不同時期的煙草植株、周邊寄主植物的病毒和介體昆蟲的監(jiān)測，保持農田環(huán)境“潔凈”，防止大規(guī)模病毒再侵染和病害的暴發(fā)流行。

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（責任編輯：田 喆）