張海濱 田雪文

摘要：DNA甲基化是基因表觀遺傳的關鍵修飾，調(diào)控基因表達，在肥胖和II型糖尿病發(fā)生機制中起關鍵作用。針對DNA甲基化檢測最經(jīng)濟高效的技術是RRBS技術。研究表明急性和慢性運動與DNA甲基化模式和基因表達的變化有關。介紹了DNA甲基化及其RRBS技術，總結目前關于運動與DNA甲基化的相關研究，以期深入了解運動誘導DNA甲基化的分子機制，并為未來研究提供方向。

關鍵詞：運動；DNA甲基化；RRBS技術

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1009-9840（2018）03-0062-04

Research progress on exercise and DNA methylation

ZHANG Hai-bin1，Tian Xue-wen2

（1. Qufu Normal University， Qufu 273100， Shandong， China； 2. Shandong Institute of Sport Science， Jinan 250102， Shandong， China）

Abstract：DNA methylation is a key modification of gene epigenetics and regulates gene expression. It plays a key role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes. The most cost-effective technique for detecting DNA methylation is RRBS technology. Studies have shown that acute and chronic exercise is associated with changes in DNA methylation patterns and gene expression. This article briefly introduced DNA methylation and its RRBS technology， summed up the current research on exercise and DNA methylation， in order to understand the molecular mechanisms of exercise-induced DNA methylation， and provide direction for future research.

Key words：exercise； DNA methylation； RRBS technology

收稿日期：2018-03-20

基金項目：山東省社會規(guī)劃辦課題 （16CTYJ22）， 山東省重點研發(fā)計劃 （2017GSF18115）。

作者簡介：張海濱（1991-），男，碩士，研究方向運動人體科學。

通訊作者：田雪文（1978-），女，博士，副研究員，研究方向運動人體科學。運動可訓練性已被證實具有強大遺傳特質(zhì)[1-2]。運動可訓練性不僅取決于遺傳基因編碼，還取決于表觀遺傳信號的修飾[3]。DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因表達的關鍵表觀遺傳修飾之一[4]。有研究表明，運動訓練能夠引起肌肉功能關鍵基因甲基化狀態(tài)的改變，從而形成良好的表達模式以提高可訓練性[3， 5-7]。運動和DNA甲基化的研究正處在迅速發(fā)展階段，本綜述總結了目前運動影響DNA甲基化的相關研究，以期深入了解運動誘導DNA甲基化的分子機制，并為未來研究提供方向。

1DNA甲基化

DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因表達的關鍵表觀遺傳修飾之一，能夠在維持原有基因組序列完整性的前提下改變遺傳表觀。1925年，在結核桿菌中最先檢測到胞嘧啶的甲基化。1948年，Rollin使用紙色譜法分離量化小牛胸腺DNA成分時，不僅鑒定出胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤四種核酸堿基，還發(fā)現(xiàn)了一種遷移率稍高于胞嘧啶名為“epi胞嘧啶”的微量成分[8]。而這種epi胞嘧啶就是胞嘧啶甲基化形式。DNA甲基化是指在胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）相鄰的核苷酸序列上[9]，S-腺苷甲硫氨酸的甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化下，通過共價結合轉(zhuǎn)移到胞嘧啶5'端的過程[10]。在哺乳動物中存在三種具有活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）：DNMT1主要負責維持DNA復制過程中甲基化狀態(tài)；DNMT3A和DNMT3B通常對未甲基化DNA或半甲基化DNA進行重新甲基化[11]。哺乳動物基因組中，大約60%～90%的CpG被甲基化[12]。其他未甲基化CpG聚集成CpG島，其約包含1%的基因組[13]。哺乳動物基因組中CpG島位于RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄基因的啟動子、第一外顯子或3'UTR區(qū)域內(nèi)，與其在基因表達中的作用一致[9]。而甲基化的CpGs（mCpGs）則抑制染色質(zhì)環(huán)境，使基因表達沉默。這是因為甲基結合蛋白（MBPs）能夠結合至少12個對稱的mCpGs，而且MBPs含有組蛋白修飾酶，導致異染色質(zhì)形成和基因沉默[14]。由此，DNA甲基化程度的高低與基因的表達和沉默密切相關。DNA甲基化在印跡基因表達模式、X染色體失活、轉(zhuǎn)位因子抑制、生物發(fā)育和許多疾病機制中發(fā)揮重要作用。隨著研究的深入，我們了解到更多DNA修飾的存在。C5位胞嘧啶的甲基化通常被用來定義“DNA甲基化”，但相同的堿基也可在其他位置甲基化，例如N3-甲基胞嘧啶（3mC）[15]。但是3mC為DNA損傷的產(chǎn)物，而非真正的信息載體[16]。此外，不僅胞嘧啶可以被甲基化靶向，腺嘌呤也能夠被甲基化，例如N6-甲基腺嘌呤[17]。最重要的是，DNA甲基化是可逆的DNA修飾。最近發(fā)現(xiàn)了C5位上的新DNA修飾，它們是由DNA去甲基化途徑產(chǎn)生的，主要包括C5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、C5-甲?；奏ぃ?fC）和C5-羧基胞嘧啶（5caC）[18]。另外，Tel酶去甲基化的活性也驗證了DNA甲基化可逆性[19]。

山東體育科技第40卷總第174期2018年第3期張海濱，等運動與DNA甲基化的研究進展No.3 20182DNA甲基化測序的RRBS技術

鑒于DNA甲基化的生物學功能及其在疾病中的作用，研究人員開發(fā)了許多技術來檢測和比較DNA甲基化。減容代表亞硫酸氫鹽測序（RRBS）技術由于其低成本，操作簡化以及對基因組CpG位點高覆蓋率而被科研者廣泛應用[20]。RRBS技術首先通過一種限制性內(nèi)切酶（如BglIII）消化基因組DNA并電泳[21]，利用亞硫酸氫鹽使DNA發(fā)生變性，未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并加上相應銜接子。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA產(chǎn)生C-poor鏈不再互補。然后用轉(zhuǎn)化的銜接子序列特定引物來填充第二條鏈（G-poor），并進行PCR擴增。最后平端PCR產(chǎn)物在質(zhì)粒載體中被克隆并測序。通過搜索簡化的BglIII片段數(shù)據(jù)庫，RRBS文庫產(chǎn)生的序列被投影到基因組上。BglIII片段在瓊脂糖凝膠中已經(jīng)按尺寸選擇和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。Meissner等[21]人通過檢測去甲基轉(zhuǎn)移酶前后小鼠胚胎干細胞甲基化譜，證實了RRBS技術的可行性。之后，科研者通過改用MspI 結合Illumina高通量測序技術和雙酶切（MspI，ApeKI）等手段優(yōu)化RRBS技術[22-24]，進一步提高了RRBS文庫建成率和檢測覆蓋率。然而分析RRBS測序數(shù)據(jù)仍是一項難題，需要專門的比對/繪圖程序。盡管已經(jīng)開發(fā)了幾種特定的RRBS序列閱讀比對程序，如BSMAP/RRBSMAP[25-26]、BSSEEKER [27]、BISMARK[28]，但仍然缺乏為研究人員提供高質(zhì)量和可分析數(shù)據(jù)的綜合解決方案。為了解決這一難題，Sun等[29]人開發(fā)了SAAP-RRBS程序，該應用程序集成了讀取質(zhì)量評估/清理、比對、甲基化數(shù)據(jù)提取、注釋、報告的可視化，并且可適用于不同BAM文件或單獨進行注釋， 此外還可以輕松擴展到分析全基因組亞硫酸氫鹽測序。在梅奧診所官方網(wǎng)站SAAP-RRBS已向科研工作者免費開放，這也將促使DNA甲基化得到更廣泛的研究。最新的報道表明，Wang等[30]人開發(fā)的Q-RRBS能夠為單細胞或含有超痕量細胞樣品的DNA甲基化分析提供最佳策略。

3運動對DNA甲基化的影響

表觀遺傳機制涉及基因調(diào)控和不同疾病的發(fā)展。環(huán)境因素可能會改變表觀基因組，運動作為環(huán)境應激因素與DNA甲基化模式和基因表達的變化有關。

3.1急性運動對DNA甲基化的影響

線粒體是骨骼肌的供能細胞器，因此對骨骼肌至關重要。骨骼肌線粒體功能適應急性運動和耐力訓練以及線粒體體積的增加[31]。在一項研究中[32]，長期久坐的年輕男女參與者暴露于急性運動中，以確定急性運動是否會改變骨骼肌中線粒體功能和能量消耗相關基因的DNA甲基化模式。進行DNA甲基化檢測時，調(diào)查的基因是PGC-1α、PDK4、MYOD1、MEF2A和CS。PGC-1α是骨骼肌中線粒體生物合成、脂肪酸氧化和胰島素抵抗的關鍵調(diào)節(jié)因子，并且在運動中被上調(diào)。PDK4是骨骼肌中與高血糖代謝相關的關鍵基因[33]，在短期高強度和長時間低強度運動后增加[34]。盡管肌肉特異性MYOD1對運動沒有明顯反應， mRNA表達沒有顯著變化，然而，PGC-1a和PDK4在運動后立即低甲基化，并在3小時后強烈轉(zhuǎn)錄[32]。 因此，高強度運動引起的DNA低甲基化和相應基因轉(zhuǎn)錄時機似乎存在差異。另外一項研究表明，糖尿病患者骨骼肌休息時PDK4啟動子具有較低的甲基化，PDK4 mRNA水平比非糖尿病患者高出70%，這可能是高胰島素血癥和胰島素抵抗的結果。而且，僅在健康參與者中，PDK4 mRNA表達響應于慢性運動而增加，在糖尿病患者中不表達[35]。還應該注意的是，骨骼肌中DNA以一種劑量反應的方式進行了低甲基化，小鼠肌肉在體外收縮45分鐘后也有類似的發(fā)現(xiàn)，這兩種結果都暗示了急性運動通過DNA甲基化作用在表觀遺傳修飾中發(fā)揮作用[36]。

3.2慢性運動對DNA甲基化的影響

慢性運動訓練后全基因組甲基化改變。Ronn等[37]人通過對健康志愿者和II型糖尿病患者運動干預前后脂肪組織DNA甲基化的監(jiān)測分析，已經(jīng)證實了慢性運動與DNA甲基化之間的關系。該研究中，兩組參與者的脂肪組織DNA甲基化都發(fā)生改變，更特別是在7 663個基因中，其中三分之一顯示出改變的mRNA表達水平，包括RALBP1、HDAC4和NCOR2。使用螢光素酶測定，顯示RALBP1啟動子的體外DNA甲基化增加抑制了轉(zhuǎn)錄活性。此外，18例肥胖和21例II型糖尿病候選基因的CpG位點在脂肪組織DNA甲基化中存在差異。這些基因中有6個被觀察到mRNA表達同時變化。為了了解體內(nèi)脂肪組織中差異的DNA甲基化和mRNA表達的基因是否影響脂肪細胞代謝，在3T3-L1脂肪細胞中分別沉默Hdac4和Ncor2，導致胰島素刺激狀態(tài)下的脂肪生成增加。這表明，運動誘導人類脂肪組織中DNA甲基化的全基因組變化，潛在影響脂肪細胞代謝。慢性運動訓練后基因特定性甲基化改變。一項隨機對照試驗（RCT）和一項臨床研究調(diào)查了慢性運動訓練對候選基因甲基化狀態(tài)的影響[38-39]。 RCT檢查了p15（細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B，一種腫瘤抑制基因）和ASC（在胞質(zhì)溶膠型炎性信號通路中含有介質(zhì)的PYD和CARD結構域）的甲基化狀態(tài)，慢性中等強度運動可以增加ASC甲基化，從而抑制過量的促炎細胞因子表達。運動誘導的DNA甲基化改變可能高度依賴于個體的基因型[40]。Alibegovic等[38]通過直接測序測量了20名年輕健康男性的干預后PGC-1a中骨骼肌甲基化的變化。連續(xù)9天的臥床休息使PGC-1a啟動子中一個CpG位點的甲基化水平增加了39%，這與PGC-1a mRNA水平的降低相關。然后，在臥床休息期后進行為期4周的再訓練干預，有改變甲基化可逆性的趨勢，但并不顯著。此外，PGC-1α的甲基化水平不再與其mRNA表達顯著相關。

4總結

DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因表達的關鍵表觀遺傳修飾之一，在印跡基因表達模式、X染色體失活、轉(zhuǎn)位因子抑制、生物發(fā)育和許多疾病機制中發(fā)揮重要作用。針對DNA甲基化檢測的RRBS技術也得到廣泛應用。已經(jīng)證實，急性或慢性運動對不同組織中DNA甲基化有顯著影響。在運動后發(fā)生甲基化水平顯著改變的基因，包括與能量代謝、肌肉再生和促炎癥相關的基因。深入研究運動訓練與DNA甲基化的關系，將為運動治療II型糖尿病及肥胖提供更加系統(tǒng)的理論支持。然而，運動導致這些DNA甲基化改變的分子途徑仍然未知，探討其分子途徑也將是今后關注的重點。

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