劉妍 張亞 項雅琴 王翀 廖曉蘭

摘要 為探明啶酰菌胺與氟啶胺復配物對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的增效潛力，采用菌絲生長速率法測定啶酰菌胺和氟啶胺復配物對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果，并根據Wadley方法評價復配物增效作用。結果表明：啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌均具有抑制作用，其EC50分別為0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL。將啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶3、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1的比例進行復配，結果表明：按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1復配對水稻紋枯病菌均具有增效作用，其中以3∶1和3∶2比例復配增效最佳，增效系數分別為7.7和5.46；以1∶1、1∶3、1∶4、1∶5和2∶3復配對水稻紋枯病菌具有相加作用。啶酰菌胺和氟啶胺對草莓灰霉病菌也具有抑制作用，其EC50分別為1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL。將啶酰菌胺和氟啶胺按照上述相同11種比例進行復配，結果顯示比例為1∶5、1∶4、1∶1、5∶1、4∶1等8種復配物對草莓灰霉病菌具有相加作用，其中以2∶1和1∶2比例復配相加效果最佳，增效系數分別為1.30和1.00，但比例為3∶2等其他比例復配則對草莓灰霉病菌表現出拮抗作用。

關鍵詞 啶酰菌胺； 氟啶胺； 水稻紋枯病菌； 草莓灰霉病菌； 復配物； 增效作用

中圖分類號： S 435.11， S 436.68

文獻標識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017230

Abstract In order to clarify the synergism of boscalid and fluazinam against Rhizoctonia solani and Botrytis cinerea， the inhibition effects of boscalid-fluazinam mixtures to R.solani and B.cinerea were investigated by mycelial growth rate test. The results showed that they both have notable inhibition effects against R.solani and B.cinerea， with the EC50 values of 0.483 6 μg/mL and 0.054 1 μg/mL， respectively. The mixtures of of boscalid and fluazinam at the ratio of 1∶2， 3∶2， 5∶1， 4∶1， 3∶1 and 2∶1 had synergism to R.solani. The mixtures at the ratio of 3∶1 and 3∶2 demonstrated the best antibacterial activities with the synergistic coefficients of 7.70 and 5.46， respectively. While the mixtures at the ratio of 1∶1， 1∶3， 1∶4， 1∶5 and 2∶3 showed only additive effects. In addition， the boscalid and fluazinam had the inhibition effect against B.cinerea， with the EC50 values of 1.637 1 μg/mL and 0.028 3 μg/mL， respectively. The mixtures at the ratio of 1∶5， 1∶4， 1 ∶1， 5∶1， 4∶1 and other 3 composites showed additive effects against B.cinerea. The ratios with the best additive effect were 2∶1 and 1∶2， with the synergistic coefficients of 1.30 and 1.00， respectively. However， the mixtures at the ratios of 3∶2 and other ratios showed antagonism.

Key words boscalid； fluazinam； Rhizoctonia solani； Botrytis cinerea； mixture； synergism

水稻紋枯病是由立枯絲核菌Rhizoctonia solani侵染引起的一種重要水稻真菌病害，通常在水稻分蘗末期或節(jié)間伸長早期開始發(fā)病，菌絲在高溫高濕條件下侵入葉片，在葉枕下形成圓形、橢圓形或長方形灰綠色水漬狀斑點向四周擴張，隨著病情發(fā)展，病斑中心變成灰白色，邊緣呈紫褐色[1]。病原菌菌絲可通過產生侵入釘穿透水稻表皮或直接通過氣孔侵入寄主體內，受侵染細胞內原生質產生顆粒物質并裂解死亡[24]。目前，隨著雜交水稻的推廣，高產品種的應用，耕作制度的變更，環(huán)境條件的變化，水稻紋枯病的危害日益加重，一般可使水稻減產5%～10%，嚴重時可減產30%～50%[5]。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea侵染引起的一種重要的草莓真菌病害。病原菌在花期通過表皮或傷口侵入果實、花瓣、葉片等組織造成危害。發(fā)病初期在花瓣和花萼處出現水漬狀斑點，后期呈褐色斑點且果實腐爛，同時在患病處形成分生孢子。病菌侵染葉片時一般從基部葉緣侵入逐漸形成黃褐色倒“V”字形病斑，侵染花瓣掉落時形成圓形壞死斑點[67]。近期，謝學文等[8]研究發(fā)現溫室中感病的草莓表現出花萼背面和果枝變紅，果實不發(fā)育，形成僵果。誘發(fā)草莓灰霉病發(fā)生的重要因素是濕度，相對濕度為64%時，爛果率低于10%；而相對濕度為80%時，爛果率上升至80%[7]。同時草莓種植密度越大，草莓灰霉病發(fā)病率越高；淺溝廂草莓由于排濕系統(tǒng)比深溝廂草莓差，因此發(fā)病率高；過量使用氮肥也會造成草莓灰霉病發(fā)病加重[9]。一般可使草莓減產20%～30%，嚴重時可減產50%以上[8]。

水稻紋枯病和草莓灰霉病均是由半知菌亞門真菌侵染引起。水稻紋枯病菌以菌絲繁殖和侵染，主要侵染禾本科農作物；草莓灰霉病菌主要以分生孢子繁殖，通過分生孢子和菌絲侵染，可侵染多種蔬菜、水果和觀賞植物[10]。水稻紋枯病菌在不良環(huán)境條件下形成黑褐色菌核，在高溫高濕環(huán)境下發(fā)生嚴重；草莓灰霉病菌在少數情況下會形成菌核，在高濕低溫環(huán)境下發(fā)生嚴重。

目前，這兩種病害主要采用農業(yè)防治、生物防治和化學防治，其中化學防治是最重要的方法，不僅可節(jié)省勞力和成本，而且能起到立竿見影的效果。井岡霉素是近年來用于防治水稻紋枯病的主要藥劑，其主要是抑制水稻紋枯病菌菌絲正常分支并誘導植株產生抗藥性[1112]。陳小龍等[12]認為水稻紋枯病菌對井岡霉素不易產生抗藥性。但吳婕等[13]通過試驗證明四川地區(qū)水稻紋枯病菌對井岡霉素的抑制中濃度逐年上升，認為已經產生了抗藥性。所以水稻紋枯病菌是否對井岡霉素產生了抗藥性這一問題還有待考證。除了井岡霉素外，吉沐祥等[14]研究發(fā)現苯醚·己唑醇對水稻紋枯病的防治效果可達56.72%，與噻呋酰胺相當。宋益民等[15]認為250 g/L嘧菌酯懸浮劑對水稻紋枯病的防效可達87.53%，而且丁香菌酯、丙環(huán)唑、戊唑醇、甲基硫菌靈和噻呋酰胺等殺菌劑對水稻紋枯病菌也有較好的抑制作用。利用化學藥劑防治草莓灰霉病方面，張傳博等[16]研究發(fā)現乙蒜·丁子香酚、苯醚甲環(huán)唑、腐霉利、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺和武夷菌素均對草莓灰霉病菌有一定抑制效果，它們的EC50分別為0.075、2.266、3.704、4.083 7、22.771、55.277 mg/L。然而，張亞等[17]發(fā)現湖南地區(qū)的草莓灰霉病菌已經對多菌靈、腐霉利和嘧霉胺產生抗藥性。趙虎等[18]發(fā)現南京、鎮(zhèn)江地區(qū)草莓灰霉病菌已經對多菌靈、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和醚菌酯產生抗藥性。由于過量使用化學藥劑，水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌已經對多種化學藥劑產生了不同程度的抗藥性，為緩解這一現象，尋找新的殺菌劑或新的途徑十分必要，而藥劑復配是一個很好的延緩抗藥性產生的研究方向。

啶酰菌胺是一種新型煙酰胺類內吸性殺菌劑，該藥是線粒體呼吸鏈上的琥珀酸輔酶Q還原酶的抑制劑，通過阻礙三羧酸循環(huán)來抑制真菌的呼吸作用[1920]，對灰霉病、菌核病和白粉病等真菌病害具有很好的效果。在過去研究中發(fā)現啶酰菌胺在草莓、黃瓜、番茄、葡萄和土壤中的殘留量均低于歐盟、韓國和日本制定的最大殘留限量[2124]，因此啶酰菌胺是較為安全的殺菌劑。氟啶胺是一種2，6-二硝基苯胺類化合物，對植食性螨類、葡萄孢屬、交鏈孢屬和十字花科植物根腫病等有顯著防治效果[2527]。許秀瑩等[28]研究發(fā)現由于土壤對氟啶胺屬于物理吸附，所以在土壤中很難淋溶。同時，何建玲[29]研究發(fā)現土壤中的腐殖酸和十二烷基苯磺酸鈉對氟啶胺光解有促進作用。因此氟啶胺是一種不易隨雨水流動污染其他土地和河流、比較安全且對環(huán)境危害小的殺菌劑。目前，有關這兩種藥劑在我國均有一定的用藥史，啶酰菌胺用于防治灰霉病的用藥史不足20年，而用于防治水稻紋枯病的研究鮮見報道；氟啶胺用于防治灰霉病和水稻紋枯病的報道也相對較少，因此，明確這兩種藥劑及復配物對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力及增效作用，對于指導農業(yè)生產有重要意義。本研究分別測試了啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力，并采用Wadley法評價其復配物增效作用，旨在提高藥劑的使用壽命，延緩病菌的抗藥性，同時，也豐富了防治兩種病害的新藥劑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani AG-1（采自瀏陽市北盛鎮(zhèn)和長沙縣金井鎮(zhèn)）和草莓灰霉病菌Botrytis cinerea Pers. ex. Fr.（采自衡東縣新塘鎮(zhèn)和郴州市北湖區(qū)華塘鎮(zhèn)）各2株由湖南農業(yè)大學植物保護學院生物農藥研究室分離、保存。98%啶酰菌胺原藥和98%氟啶胺原藥，購自上海秦巴化工有限公司。VS-840K-U潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；ME204E分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；1 000 μL移液槍，德國Eppendorf；MJP-250型霉菌培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；LDZX-75KB滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 啶酰菌胺和氟啶胺毒力測定

利用菌絲生長速率法測定啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各選2株菌進行測試）。將啶酰菌胺和氟啶胺用適量丙酮溶解，用含適量吐溫-80的無菌水制備成母液，接著按表1所列質量比用無菌水稀釋為系列濃度（表1），加入熔化后的滅菌PDA中，制成含藥PDA平板。同時設置不加藥劑的無菌水空白對照，每處理設3個重復，在平板中央接入直徑約7 mm的新鮮菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測量菌落直徑并計算平均值，按照以下公式計算不同濃度處理下的菌絲生長抑制率，根據所得的抑制率用DPS 6.55軟件計算出回歸方程和EC50。

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑增長長度-處理濃度菌落直徑增長長度）/對照菌落直徑增長長度]×100%。

1.3 最佳配比預選

采用交互測定法進行最佳配比的篩選[3031]。以啶酰菌胺和氟啶胺的EC50為基礎，按EC50劑量百分比設置2個單劑和11個混劑，共13個處理（表1），每處理3個重復。毒力測定同1.2，測量各菌落直徑增加長度并計算實際抑制率，再根據下列公式計算各配比的毒性比率。

預期抑制濃度=啶酰菌胺EC50劑量實際抑制率×配比中啶酰菌胺EC50劑量百分比+氟啶胺EC50劑量實際抑制率×配比中氟啶胺EC50劑量百分比。

毒性比率=實際抑制率/預期抑制率；毒性比率>1.25時，表現為增效作用；毒性比率<0.75時，表現為拮抗作用；0.75≤毒性比率≤1.25時表現為相加作用。

1.4 復配劑毒力測定

利用生長速率法測定啶酰菌胺和氟啶胺混劑對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的毒力（各選2株菌進行測試）。將啶酰菌胺和氟啶胺按照表1中的比例進行復配，加入熔化的滅菌PDA中，制成含藥PDA平板。同時設置不加藥劑的無菌水空白對照，每處理設3個重復，在平板中央接入直徑約7 mm的新鮮菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h。按照1.2的測量和計算方法，計算出各復配藥劑的EC50和回歸方程，再根據Wadley方法計算增效系數（SR）評價混劑的增效作用。

式中a、b分別代表兩種藥劑在混劑中所占比例，ob為實際觀察值，th為理論值。SR>1.5為增效作用；0.5≤SR≤1.5為相加作用；SR<0.5為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 啶酰菌胺和氟啶胺對兩種病菌的抑制效果

試驗結果表明，啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌均表現出較好的抑制效果。氟啶胺對水稻紋枯病菌的毒力最強，EC50和相關系數分別為0.054 1 μg/mL和0.986 9；啶酰菌胺對水稻紋枯病菌的EC50和相關系數分別為0.483 6 μg/mL和0.984 6。氟啶胺對草莓灰霉病菌的毒力最強，EC50和相關系數分別為0.028 3 μg/mL和0.985 7；啶酰菌胺對草莓灰霉病菌的EC50和相關系數分別為1.637 1 μg/mL和0.985 1。

2.2 啶酰菌胺和氟啶胺最佳配比的預選

以啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌和草莓灰霉病菌的近似EC50（分別為0.48，0.05，1.64和0.028 μg/mL）為基礎，依據交互測定法進行最佳配比的篩選。結果表明：啶酰菌胺和氟啶胺按照1∶3和1∶5復配對水稻紋枯病菌表現出增效作用，毒性比率分別為1.25和1.33，按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2和1∶4復配對水稻紋枯病菌表現出相加作用，毒性比率分別為0.78、0.78、0.87、0.79、0.82、1.02、1.24、1.17和1.15。啶酰菌胺和氟啶胺按照3∶1、2∶1、3∶2、2∶3、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5復配對草莓灰霉病菌表現出相加作用，毒性比率分別為0.86、0.94、0.81、1.01、1.01、1.02、1.09、0.97和1.05，按照5∶1和4∶1復配對草莓灰霉病菌表現出拮抗作用，毒性比率均為0.73（表2）。

2.3 啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例為1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1時對水稻紋枯病菌表現出明顯的增效作用，增效系數分別為1.52、5.46、3.44、2.6、7.7和1.98（表3）。其他配比表現出相加作用。

2.4 啶酰菌胺和氟啶胺對草莓灰霉病菌的增效作用

啶酰菌胺和氟啶胺比例為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、5∶1、4∶1和2∶1時對草莓灰霉病菌表現出明顯的相加作用，其中按照2∶1和1∶2比例復配對草莓灰霉病菌抑制效果最好，增效系數為1.3和1.0（表4）。

3 結論與討論

本研究結果表明：啶酰菌胺和氟啶胺均對水稻紋枯病菌有較好的抑制作用，EC50分別為0.483 6 μg/mL和0.054 1 μg/mL，其中啶酰菌胺對水稻紋枯病菌的毒力高于陳宏州等[32]得到的結果（EC50為1.069 2 μg/mL）。同時，這兩種藥劑的毒力也高于井岡霉素（EC5070.2 μg/mL）、戊唑醇（EC500.509 μg/mL）和丙環(huán)唑（EC500.045 μg/mL）[11，3334]，表現出防治水稻紋枯病的潛力。

啶酰菌胺和氟啶胺對草莓灰霉病菌的EC50分別為1.637 1 μg/mL和0.028 3 μg/mL，其中啶酰菌胺對草莓灰霉病菌的毒力高于楊敬輝等的測定結果[35]（EC50為3.980 3 μg/mL）。同時，這兩種藥劑的毒力效果也好于腐霉利（EC503.704 μg/mL）、嘧霉胺（EC504.837 μg/mL）、苯醚甲環(huán)唑（EC502.266 μg/mL）、嘧菌環(huán)胺（EC5022.771 μg/mL）和武夷菌素（EC5055.277 μg/mL）[16]，具有防治草莓灰霉病的潛力。

啶酰菌胺與氟啶胺按照1∶2、3∶2、5∶1、4∶1、3∶1和2∶1比例復配對水稻紋枯病菌表現出較高的增效作用。啶酰菌胺與氟啶胺按照2∶1和1∶2比例混合時對草莓灰霉病菌有相加作用。從經濟效益和環(huán)保的角度考慮，建議田間控制水稻紋枯病可采用啶酰菌胺與氟啶胺2∶1進行配比。盡管啶酰菌胺和氟啶胺復配物對草莓灰霉病菌未表現出明顯增效作用，但按照2∶1和1∶2配比仍然有一定相加作用，其中以比例2∶1為最佳配比，增效系數為1.30。

利用復配來防治水稻紋枯病和草莓灰霉病可以減少成本、延緩病原菌抗藥性形成，達到更理想和安全的防治效果。啶酰菌胺和氟啶胺的復配物對水稻紋枯病菌的最高增效系數可達7.70，明顯高于苯醚甲環(huán)唑與己唑醇按照1.5∶1.0復配的增效系數1.14[14]、嘧菌酯與己唑醇按照1∶2復配的增效系數1.55[36]以及5%井岡霉素水劑與85%氯胺磷可溶性粉劑以1∶4復配增效系數2.26[37]。由此可見，盡管目前已經有多種藥劑的復配物對水稻紋枯病菌有明顯抑制效果，但其增效系數均低于啶酰菌胺和氟啶胺的復配物，所以啶酰菌胺與氟啶胺復配具有進一步開發(fā)為新型農藥的潛力。啶酰菌胺和氟啶胺的復配物對抑制草莓灰霉病菌的最高增效系數為1.30（EC50為0.286 3 μg/mL），抑制效果與嘧菌環(huán)胺和腐霉利按照1∶1和1∶2比例復配（EC50分別為0.062 mg/L和2.005 mg/L）和乙蒜素與苯醚甲環(huán)唑按照1∶2和2∶1復配（EC50分別為0.065 mg/L和0.833 mg/L）[16]不相上下，且抑制效果明顯優(yōu)于部分藥劑配比的效果。

啶酰菌胺和氟啶胺主要用于對葡萄孢屬等真菌病害的防治，本試驗結果表明，啶酰菌胺和氟啶胺對水稻紋枯病菌也有很好的抑菌作用，兩者復配更是表現出了一定的增效作用，后期可以再探究這兩種藥劑對其他病原菌是否也具有明顯的抑制效果，從而擴展兩種藥劑的應用范圍。另外，啶酰菌胺和氟啶胺混配的增效機制、后期混配產品劑型的研制、產品的環(huán)境行為以及檢測方法等均有待進一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）