劉彩琴 陳虹 王楠等

黃酒浸米水中微生物及細(xì)菌素研究進(jìn)展

劉彩琴，陳 虹，王 楠，金建昌 （浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015）

摘要 黃酒浸米過程中微生物是由群落控制的，大量的微生物和豐富的發(fā)酵產(chǎn)物是保障黃酒發(fā)酵在開放條件下正常和順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一。從浸米水中微生物及作用、具有抑菌活性的微生物及抑菌物質(zhì)、乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性等方面進(jìn)行綜述，并對(duì)今后發(fā)展進(jìn)行展望，以期為浸米水的綜合利用提供一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 乳酸菌；細(xì)菌素；黃酒

中圖分類號(hào) TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）32-0004-03

Research Progress of Antibiotics from Rice Steeping Water of Huangjiu

LIU Caiqin， CHEN Hong ， WANG Nan et al （College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University， Hangzhou，Zhejiang 310015）

Abstract Microorganism is controlled by community during rice soaking of Huangjiu.Large number of microorganisms and abundant fermented products are the key factors to ensure the Huangjiu fermentation successfully.This paper summarized the research progress of microorganism from rice steeping water of Huangjiu and its function， microorganism with antimicrobial activity and antibiotics， characteristics of bacteriocin produced by lactic acid bacteria .The future research areas were also resumed.It can provide reference for comprehensive utilization of rice steeping water.

Key words Lactic acid bacteria；Bacteriocin；Huangjiu

基金項(xiàng)目 浙江樹人大學(xué)紹興黃酒學(xué)院科研專項(xiàng)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 劉彩琴（1975—），女，甘肅涇川人，副教授，博士，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期 2018-07-17

黃酒（Huangjiu）是以稻米、黍米等為主要原料，經(jīng)浸米、蒸煮、加曲、糖化發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成[1-2]，是我國(guó)民族特產(chǎn)和傳統(tǒng)食品之一。黃酒浸米的主要目的是原料充足吸水，以保障發(fā)酵的順利進(jìn)行與風(fēng)味的產(chǎn)生，浸米過程中微生物及其豐富的發(fā)酵產(chǎn)物是保障黃酒發(fā)酵在開放條件下正常和順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一，同時(shí)其多種代謝產(chǎn)物對(duì)于黃酒風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響，比如乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸是黃酒風(fēng)味物質(zhì)的重要來源[3-4]。浸米水中含量豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等，其中氨基酸的種類多達(dá)18 種，還有微量元素、B族維生素和礦物質(zhì)等[5]，還含有一些生理活性物質(zhì)，其中抑菌物質(zhì)的研究及應(yīng)用還處于發(fā)展階段，但應(yīng)用前景非常廣闊。該研究從黃酒浸米水中微生物的種類、產(chǎn)抑菌活性的微生物及細(xì)菌素特性進(jìn)行綜述，以期為浸米水的綜合利用提供參考。

1 浸米水中微生物及作用

一般而言，微生物相互作用是微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定形成的重要基礎(chǔ)，也是代謝產(chǎn)物分泌的基礎(chǔ)。黃酒浸米水中微生物是由群落控制的，大量的微生物和豐富的代謝產(chǎn)物對(duì)黃酒品質(zhì)起關(guān)鍵作用。毛青鐘[6-7]應(yīng)用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，浸米水內(nèi)微生物種類極其豐富，包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌等類群；浸米前期，漿水表面主要是醋酸桿菌、乳酸桿菌，數(shù)量巨大，形成一層半透明狀的膜，隨后，有些浸米池表面又會(huì)形成泡沫花狀的白色膜，以產(chǎn)膜酵母、裂殖酵母和白地霉組成，這類微生物對(duì)浸米有害；浸米溫度越高，此膜出現(xiàn)的比例越大。漿水內(nèi)的酵母以巨大酵母、假絲酵母和極少量的釀酒酵母等為主，數(shù)量少，對(duì)浸米水的產(chǎn)酸作用很小，而對(duì)漿水中產(chǎn)生的風(fēng)味成分有一定作用。當(dāng)浸米水的 pH小于4.5 時(shí)，球菌的數(shù)量已很少，很難檢測(cè)到。以后漿水酸度升高，浸米過程以桿菌的作用為主，浸米后期，乳酸桿菌所占比例越大（超過85%）。當(dāng)浸米結(jié)束，僅有極少量的乳酸球菌（對(duì)生和四鏈生）存在，乳酸球菌存在于浸米的整個(gè)過程，數(shù)量非常少，只起到很小的作用。另外，尚有少量的芽孢乳桿菌屬和產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌如凝結(jié)芽孢桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌等存在于浸米的整個(gè)過程，但數(shù)量非常少[6-7]。朱小芳等[3]通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)黃酒浸米水中細(xì)菌研究發(fā)現(xiàn)，浸米過程中乳酸菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其豐度含量占比為60.67%，有乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等，其中乳桿菌屬含量占乳酸菌的90%，57.4%的Lactobacillus為植物乳桿菌（L.plantarum），21.1% 的為短乳桿菌（L.brevis），其他種均不超過10%，如類食品乳桿菌（L.paralimentarius）等。在生產(chǎn)過程中，還有一些微生物雖參與黃酒的發(fā)酵，但是在傳統(tǒng)的培養(yǎng)過程中不能獲得其菌落及生物學(xué)信息，所以對(duì)其認(rèn)識(shí)相當(dāng)有限。

2 浸米水中分泌抑菌活性的微生物及抑菌物質(zhì)

在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，相同工藝、相同底物發(fā)酵濃度釀成的紹興黃酒，因浸米時(shí)間不同（傳統(tǒng)攤飯法釀酒，浸米時(shí)間長(zhǎng)達(dá)16～26 d，機(jī)械化黃酒生產(chǎn)時(shí)浸米時(shí)間縮短至2～5 d）[8]，其貯藏的安全性不一致，浸米時(shí)間長(zhǎng)釀得的酒，入壇后能夠久藏不壞，反之則不易久藏，有人認(rèn)為與浸米發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)物息息相關(guān)，這類物質(zhì)統(tǒng)稱為抑菌成分，而且這種抑菌成分伴隨著發(fā)酵，最后進(jìn)入成品黃酒中。能分泌抑菌物質(zhì)的乳酸菌有乳球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬等，抑菌物質(zhì)有有機(jī)酸（乳酸、乙酸、苯甲酸、丙酸）、過氧化氫、CO2、雙乙酰、乙醛、D-氨基酸、抗真菌肽、羅氏菌素（reuterin）和細(xì)菌素（bacteriocins）等[9-10]。成瀟龍等[11]以金黃色葡萄球菌為指示菌研究發(fā)現(xiàn)黃酒釀造浸米水中抑菌物質(zhì)為乳酸鏈球菌素。酵母分泌的抑菌物質(zhì)研究較少，對(duì)僅有的一些報(bào)道分析發(fā)現(xiàn)：釀酒酵母IFST062013的抑菌能力與其分泌的α-干擾素（IFN-α）、γ-干擾素（IFN-γ）和白介素10（IL-10）有關(guān)[12]，釀酒酵母CCMI 885的抑菌能力與其分泌的抗菌肽 （AMPs）有關(guān)[13]。

3 乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素生物特性研究進(jìn)展

乳酸菌在食品領(lǐng)域有很重要的生理功能，而其分泌的細(xì)菌素的開發(fā)及應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體途徑合成的一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)[14]，除了具有能被人體內(nèi)的蛋白酶降解、不在體內(nèi)蓄積等優(yōu)點(diǎn)之外，還具有較好的穩(wěn)定性及適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)[15]，目前細(xì)菌素具有抗病毒[16]、調(diào)節(jié)腸道菌群[17-18]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19]、抑菌[20]等功能，所以在食品、醫(yī)藥和獸藥等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。美國(guó) FDA 認(rèn)證細(xì)菌素為 GRAS生物制劑。

目前，依據(jù)熱穩(wěn)定性可將乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素分為對(duì)熱穩(wěn)定的Class I和Class II，以及對(duì)熱不穩(wěn)定的Class III[21]。

Class I是由核糖體合成、翻譯后被修飾得到的一類肽類（RiPPs），分子量小于10 kD，包括所有合成過程中需要酶修飾的肽，經(jīng)修飾之后氨基酸和結(jié)構(gòu)更利于其功能的發(fā)揮，這些修飾如：羊毛硫氨酸、雜環(huán)化、N- 和C-端被一個(gè)肽鍵鏈接起來的環(huán)化和糖基化作用；Class I的基因里包含一個(gè)對(duì)酶識(shí)別、肽轉(zhuǎn)錄和控制肽失活的前導(dǎo)肽，此前導(dǎo)肽位于核心肽段上[22]。Class I的代表性物質(zhì)有羊毛硫肽類化合物（Lanthipeptides），如 Nisin A；環(huán)化的肽類化合物（Cyclized peptides）如促腸活動(dòng)素（Enterocin AS-48）；含吡咯或唑啉環(huán)的線性肽（LAPs，Linear azol（in）e-containing peptides）如鏈球菌溶血素（Streptolysin S）；Sactibiotics如 Subtilosin A；含有糖基片段類（Glycocins）如 Glycocin F；套索肽類（Lasso peptides）如E.coli產(chǎn)的Microcin J25。2010年Mkrtchyan等[23]從嗜酸乳桿培養(yǎng)液中分離得到分子量大小只有1.15 kD 的Ⅰ類細(xì)菌素，其氨基酸序列為Asn-Val-Gly-Val-Leu-X-Pro-Pro-X-Leu-Val。

Class II分子量小于10 kD，在合成過程中不需要修飾，理化性質(zhì)穩(wěn)定，又分為IIa、IIb、IIc 和IId 4 個(gè)亞類。IIa 類細(xì)菌素是II 類細(xì)菌素中主要的亞種，抗菌譜相比Ⅰ類細(xì)菌素較窄，僅對(duì)乳酸菌、李斯特菌等革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出抗菌活性，極少數(shù)對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)抗菌活性[24]；以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產(chǎn)生的乳酸片球菌素（Pediocin PA-1）為主要代表，具有保守的 N-末端YGNGVXC保守序列[15]；IIb 類細(xì)菌素是由2種不同的肽分子組成的多肽，當(dāng)每種肽的肽比率相等時(shí)才會(huì)發(fā)揮協(xié)同作用，產(chǎn)生最佳抗微生物活性[25]，已報(bào)道的有乳球菌素G（lactococcin G）、萵苣苦素F（lactacin F）、乳桿菌素705（lactobacillin 705）、乳球菌素Q（lactococcin Q）、腸道菌素X（enterocin X）和腸道菌素NKR-5-3AZ（enterocinNKR-5-3AZ）[24，26]。Ⅱc 類細(xì)菌素的分子主鏈具有頭-尾環(huán)化的結(jié)構(gòu)特征，已報(bào)道的有腸道菌素AS-48 （enterocin AS-48）、加薩霉素（gassericin A）、環(huán)孢菌素A、丁基弧菌素AR10、溶血素、卡諾菌素A、乳環(huán)素Q、加爾維因M （Galviin M）、白細(xì)胞環(huán)素Q（leucocyclicin Q）、環(huán)孢霉素和環(huán)孢霉素4185等[27]。Ⅱd 類細(xì)菌素包括非單線性肽，sec依賴性細(xì)菌素以及具有N-末端前導(dǎo)序列，并在翻譯后立即有活性的無前導(dǎo)序列細(xì)菌素，已報(bào)道的是從泰國(guó)發(fā)酵豬肉香腸中分離出的Bac7293A 和Bac7293B[25] 。

Class III 分子量大于10 kD，代表性物質(zhì)之一如溶菌素（Bacteriolysins）是一種不耐熱的大分子抗菌蛋白，不同的結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)易位、受體結(jié)合和致死功能，以通過水解靶細(xì)胞的細(xì)胞壁使細(xì)胞溶解[28-29]；代表性物質(zhì)之二為非裂解素（Non-lytic），其相關(guān)研究較少。

4 乳酸菌細(xì)菌素的抑菌機(jī)理

不同類型的細(xì)菌素抑菌機(jī)理不同，細(xì)胞膜蛋白、膜電位、pH、脂質(zhì)組成、特定氨基酸和結(jié)構(gòu)域等對(duì)抑菌活性有影響，總的來說包括細(xì)胞膜損傷機(jī)制、阻礙細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁損傷機(jī)制[30-31]。

Nisin作為Class I的代表，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和美國(guó)食品藥品管理局所認(rèn)可并批量商業(yè)化生產(chǎn)，作為一種天然防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品的保鮮和預(yù)防食物中毒，它僅對(duì)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、產(chǎn)氣莢膜桿菌（Clostridium perfringens）、鏈球菌（Streptococcus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）等革蘭氏陽性菌有抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌沒有抑制作用，而且Nisin具有雙重的作用機(jī)制，Nisin濃度很低時(shí)，通過抑制細(xì)胞壁合成起作用；當(dāng)Nisin濃度相對(duì)較高時(shí)，主要是通過孔膜形成來起作用[32-33]； Class II類細(xì)菌素的抗菌機(jī)理在近幾年才漸為人知，主要是由于細(xì)菌素吸附在細(xì)胞膜并在其上形成孔道，使得細(xì)胞膜的通透性增加，從而引起細(xì)胞內(nèi)各種離子的滲漏和能量物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致細(xì)胞解體死亡[34]；Class III細(xì)菌素已發(fā)現(xiàn)的數(shù)量還不太多，研究也并不深入，具體作用機(jī)制還在研究[35]。

5 展望

黃酒是我國(guó)的民族特產(chǎn)和傳統(tǒng)食品，也是世界上最古老的飲料酒之一。浸米過程產(chǎn)生的浸米水是黃酒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，其中的乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是天然的抗菌肽或蛋白質(zhì)，潛在用于食品保藏和保健、飼料行業(yè)、醫(yī)療工業(yè)領(lǐng)域而備受關(guān)注，特別是在食品保藏方面具有巨大的潛在價(jià)值，其前景十分廣闊。Class II類乳酸菌細(xì)菌素具有較穩(wěn)定的理化性質(zhì)，為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但是研究相對(duì)較少。就目前應(yīng)用效果來看，不同的細(xì)菌素聯(lián)合或細(xì)菌素與動(dòng)植物來源的抗菌肽聯(lián)合使用可拓寬抑菌范圍和（或）增強(qiáng)抑菌效果。

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