柳科歡 白歡 馬力 蘭利瓊 卿人韋

摘要 [目的]篩選出利于實驗室來源的雨生紅球藻營養(yǎng)生長的培養(yǎng)基，優(yōu)化雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的積累條件。[方法]選用7種培養(yǎng)基對4株雨生紅球藻分別進行培養(yǎng)，篩選出最適于4種藻株營養(yǎng)生長的培養(yǎng)基。探究雨生紅球藻在光脅迫、高鹽、缺氮3種條件下誘導(dǎo)蝦青素積累情況。[結(jié)果]4個不同雨生紅球藻藻株在配方A培養(yǎng)基中的生物量比其他6種試驗培養(yǎng)基的生物量高1.65～7.30倍；在優(yōu)勢培養(yǎng)基配方A中，HP3的生物量最大，可達7.13×106 個/mL；HP3在缺氮的脅迫條件下，蝦青素產(chǎn)量最高，可達21.05 mg/L，比光誘導(dǎo)獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高1.07倍，比高鹽獲得的最佳蝦青素產(chǎn)量高1.64倍。[結(jié)論]該研究中最適于試驗藻株營養(yǎng)生長的培養(yǎng)基是配方A，當脅迫條件為缺氮10%時蝦青素積累量最大。

關(guān)鍵詞 雨生紅球藻；蝦青素；培養(yǎng)基篩選；脅迫條件

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0013-04

Medium Optimization and Inducing Conditions Optimization of Haematococcus pluvialis

LIU Kehuan1 ，BAI Huan2，MA Li1 et al

（1.College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu，Sichuan 610064；2. Electric Power Research Institute of Sichuan Electric Power Company， Chengdu，Sichuan 610072）

Abstract [Objective] Medium for culturing Haematococcus pluvialis originated from laboratory was screened， accumulation conditions of astaxanthin in Haematococcus pluvialis were optimizated .[Method] Seven culture mediums were used to cultivate four kinds of Haematococcus pluvialis， 4 kinds of mediums were obtained. Astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis were exposed under lightinduced， highsalt， and nitrogendeficient respectively. [Result]Biomass about four strains algae in the formula A medium was 165-7.30 times of that in the other six mediums， HP3 gained the largest biomass in formula A， the maximum biomass was up to 7.13×106 cell/mL. Under nitrogen deficiency condition， the astaxanthin production was up to 21.05 mg/L， this number was 1.07 times of the best astaxanthin yield obtained by light， and 1.64 times of the maximum astaxanthin yield obtained by high salt. [Conclusion] The most suitable Haematococcus pluvialis medium was formula A and the regnant astaxanthin accumulation condition was 10% in this study.

Key words Haematococcus pluvialis；Astaxanthin；Medium optimization；Stress conditions

基金項目 四川省科技廳項目（2014JY0171）；四川省電科院項目（13H1138）。

作者簡介 柳科歡（1994—），女，貴州興義人，碩士研究生，研究方向：藻類分類及資源利用。

*通訊作者，副教授，博士，從事藻類學及能源微藻油脂代謝領(lǐng)域研究。

收稿日期 2018-07-17

蝦青素（3，3-二羥基-β，β-胡蘿卜素-4，4-二酮）是一種次生類胡蘿卜素，具有一個多烯鏈，鏈兩端各接一個β環(huán)，每個β環(huán)上又各含有一個羥基和一個酮基，13個共軛雙鍵與單鍵交替存在于蝦青素結(jié)構(gòu)中，這賦予了蝦青素強抗氧化能力，可中和細胞內(nèi)自由基和清除細胞內(nèi)活性氧[1-3]，蝦青素的這種特性使得其被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、水產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、化妝品等多個行業(yè)。目前，市場上的蝦青素95%以上是化學合成，只有不到1%是藻類來源[4-6]。合成蝦青素存在食品安全、環(huán)境污染和產(chǎn)品活性低等問題[5，7-8]，所以相對于合成蝦青素而言，天然蝦青素有更好地發(fā)展前景。雨生紅球藻被公認為自然界中最具商業(yè)價值的天然蝦青素來源。雨生紅球藻中蝦青素的生物合成和積累需在脅迫條件下進行，然而脅迫條件并不利于藻株的營養(yǎng)生長，所以現(xiàn)在通過雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素在工業(yè)上是通過2個步驟來進行，即先進行雨生紅球藻綠色營養(yǎng)細胞生長積累藻類生物量，然后進行雨生紅球藻脅迫積累蝦青素。

雨生紅球藻綠色營養(yǎng)生長時期的生物量決定蝦青素的總產(chǎn)量，所以雨生紅球藻培養(yǎng)條件的探索，依然是利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素這一領(lǐng)域的重要課題。一些報道顯示，普通的微藻無機培養(yǎng)基不利于雨生紅球藻生物量的大量積累，雨生紅球藻綠色營養(yǎng)細胞的高產(chǎn)需要在有機培養(yǎng)基中實現(xiàn)[9]。雨生紅球藻對培養(yǎng)基中的pH變化比較敏感，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基成分不斷消耗，藻細胞代謝物持續(xù)產(chǎn)生，培養(yǎng)基中的pH發(fā)生變化，進而限制藻的生物量。目前已有研究證明，在藻種培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)液中通入1%～2%的CO2（CO2/air），可有效解決由pH變化和營養(yǎng)物消耗引起的藻細胞生長受限的問題[10]，實際操作中基于通氣過程中氣體流失的考慮，通氣量需高于理論值。

雨生紅球藻在脅迫過程中，尤其是脅迫前期，藻中積累的蝦青素含量很低，不易直接測定。雨生紅球藻在脅迫條件下，其細胞內(nèi)初級類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為次生類胡蘿卜素（主要是蝦青素，其占總類胡蘿卜素的80%～99%），總類胡蘿卜素含量明顯增加[11-12]，所以可通過測定雨生紅球藻中總類胡蘿卜素變化量來側(cè)面反應(yīng)蝦青素積累情況。

為了篩選出最適于試驗藻株營養(yǎng)生長的培養(yǎng)基，以提高藻中蝦青素的產(chǎn)量，該研究選用7種雨生紅球藻培養(yǎng)基（BBM、OHM、改良MCM、配方A、BG11、BG11-1、BG11-21），對HP1、HP2、HP3、HP4 4株雨生紅球藻藻株進行比較培養(yǎng)。再利用篩選出的優(yōu)勢培養(yǎng)基和在優(yōu)勢培養(yǎng)基中長勢最好的藻株，研究不同光照強度、高鹽、缺氮脅迫條件下蝦青素的積累情況。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種和基本培養(yǎng)條件

試驗藻種雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）HP1、HP2、HP3、HP4，是通過分離純化、長期保存的藻株。

1.2 培養(yǎng)基篩選時期的培養(yǎng)條件

雨生紅球藻培養(yǎng)條件：初始接種量為2.00×104 個/mL，培養(yǎng)溫度為（24±1）℃，光照強度為1 500～1 800 lx，光照周期是12 h/12 h（光/暗），通氣條件為4%（CO2/air，v/v），在500 mL三角瓶中盛裝400 mL培養(yǎng)基。每個試驗做3瓶平行對照，每瓶每次取2個樣測定參數(shù)。

1.3 蝦青素脅迫時期的培養(yǎng)條件和脅迫條件的設(shè)定

利用配方A培養(yǎng)基培養(yǎng)HP3藻株，基本培養(yǎng)條件為：溫度（24±1）℃，光照強度1 500～1 800 lx，光照周期12 h/12 h（光/暗），通氣量4%（CO2/air，v/v），培養(yǎng)規(guī)模是1 000 mL三角瓶培養(yǎng)700 mL藻液。HP3在配方A中培養(yǎng)15 d后，藻液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后收集藻細胞，用少量配方A培養(yǎng)基重懸藻細胞，將懸浮液均分轉(zhuǎn)至各脅迫條件下培養(yǎng)，脅迫培養(yǎng)的接種濃度為5×105～6×105 個/mL，脅迫培養(yǎng)時除脅迫變量外，其他培養(yǎng)條件不變。

選取3個因素（光照強度、高鹽和缺氮）進行脅迫研究。光脅迫研究中，光源為opple三基色（紅綠藍）、24 W，設(shè)置8 000、10 000、12 000 lx 3個光照強度的梯度；高鹽脅迫研究是在10 000 lx光照強度基礎(chǔ)上，向配方A培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaAc，設(shè)置20、30、40、50 mmol/L NaAc 4個濃度梯度；缺氮脅迫研究，是在10 000 lx光照強度基礎(chǔ)上，將配方A培養(yǎng)基中NaNO3（含氮4 mmol/L）的含量調(diào)整為原培養(yǎng)基的5%、10%、15%、20%。

每個脅迫條件做3瓶平行對照，每天取一次樣進行色素含量檢測，每瓶每次測2個樣。

46卷27期 柳科歡等 雨生紅球藻培養(yǎng)基篩選及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

1.4 色素提取與測定

取5 mL藻液，經(jīng)4 000 r/min離心15 min，棄上清，再加入1 mL DMSO，混合均勻后65 ℃水浴5 min，待樣品冷卻至室溫后，7 000 r/min離心2～3 min收集上清液，所得的沉淀用DMSO反復(fù)提取至基本無色，合并收集所得的上清液并定容到5 mL待測。

紫外分光光度計檢測色素含量，用DMSO稀釋待測提取液使其分光光度計讀數(shù)在0.2～1.5范圍，DMSO作為空白對照，分別在波長666、649、480 nm處讀取數(shù)據(jù)，計算公式如下：

Cchla（mg/L）=（13.34×A666-4.85×A649）×稀釋倍數(shù)（1）

Cchlb（mg/L）=（24.58×A649-6.65×A666）×稀釋倍數(shù)（2）

Ccar（mg/L）=（1 000×A480-1.29×Cchla-4.85×Cchlb）/220×稀釋倍數(shù)（3）

式中，A666、A649、A480分別為待測樣品在波長480、649、666 nm處吸光值；

Cchla、Cchlb、Ccar分別為葉綠色a、葉綠色b、總類胡蘿卜素含量。

1.5 蝦青素測定方法

準確稱取0.25 g NaOH加入雙蒸水4.75 mL，得5%氫氧化鈉溶液，待用。取藻液5 mL，經(jīng)3 900 r/min離心15 min，收集沉淀，向沉淀中加入700 μL 5%氫氧化鈉溶液和300 μL甲醇溶液，混勻，65 ℃水浴加熱15 min除去樣品中的葉綠素，待加熱后的樣品冷卻至室溫后，7 000 r/min離心2～3 min收集沉淀，用雙蒸水洗滌沉淀3次，再向沉淀中加入1 mL DMSO，65 ℃水浴加熱5 min，待樣品冷卻至室溫，7 000 r/min離心2～3 min收集上清液，沉淀用DMSO重復(fù)提取至基本無色，合并收集的上清液并定容于5 mL。

用紫外分光光度計檢測提取樣品，DMSO為空白對照，檢測波長是490 nm，蝦青素含量由以下公式計算：

Cast（mg/L）=（4.5×A490×V1）/V2×稀釋倍數(shù)（4）

式中，A490為待測樣品在波長490 nm處吸光值；

Cast為蝦青素含量；

V1、V2分別為提取所得液體體積、提取所用藻液體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

4株試驗藻種在不同培養(yǎng)基中的生長情況如圖1所示。同一藻種在7種試驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后，各組藻生物量出現(xiàn)明顯差異。HP1在配方A培養(yǎng)基中生物量最大，可達6.44×106個/mL，在改良MCM培養(yǎng)基中生物量最低，為1.73×106 個/mL；HP2在配方A中的生物量（5.07×106 個/mL）最大，在OHM中的生物量（2.67×106 個/mL）次之；HP3在配方A中生物量最大，為7.13×106 個/mL，是HP3在改良MCM中的7.29倍；HP4在7種試驗培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)23 d后，各種培養(yǎng)基及其對應(yīng)的生物量情況如下：配方A（5.16×106 個/mL）、OHM（2.94×106 個/mL）、BG11-1（2.91×106 個/mL）、BG11（2.60×106 個/mL）、BBM（2.53×106 個/mL）、BG11-2.1（1.88×106 個/mL）、改良MCM（1.33×106 個/mL）。

上述結(jié)果表明，HP1、HP2、HP3、HP4 4株試驗藻株篩選的優(yōu)勢培養(yǎng)基的結(jié)果一致，都顯示藻株在配方A中的生物量最高。

2.2 蝦青素誘導(dǎo)

如圖2所示為HP3在不同脅迫條件下總類胡蘿卜素變化。在3種脅迫條件下處理9 d，隨著處理時間的延長，藻液中總類胡蘿卜素呈現(xiàn)增長趨勢。光誘導(dǎo)9 d后，光照強度為10 000 lx條件下藻液中類胡蘿卜素含量最高，為12.10 mg/L；10 000 lx條件下，高鹽脅迫9 d后，30 mmol/L NaAc條件下藻液中類胡蘿卜素含量最高，達8.91 mg/L，50 mmol/L NaAc條件下藻液中類胡蘿卜素含量最低，為5.87 mg/L；在10 000 lx條件下，缺氮脅迫9 d后，各梯度下總類胡蘿卜素含量情況是10%（22.46 mg/L）、5%（21.35 mg/L）、15%（18.62 mg/L）、20%（14.24 mg/L）。

結(jié)果表明，缺氮脅迫下藻液中總類胡蘿卜素含量，比光誘導(dǎo)和高鹽2種脅迫條件下大。

如圖3所示為HP3在不同脅迫條件處理9 d后蝦青素積累情況。HP3在光脅迫9 d后，光照強度為10 000 lx時蝦青素含量最高，可達10.17 mg/L；光照強度10 000 lx時，HP3在高鹽脅迫9 d后，30 mmol/L NaAc條件下蝦青素含量最高，為7.97 mg/L，50 mmol/L NaAc條件下蝦青素含量最低，為3.16 mg/L；缺氮脅迫9 d后，各梯度下蝦青素含量情況是：10%（21.05 mg/L）、5%（19.93 mg/L）、15%（16.71 mg/L）、20%（12.86 mg/L）。

上述結(jié)果表明，10 000 lx條件下，缺氮脅迫下藻液中蝦青素含量以及脅迫前后藻液，比光誘導(dǎo)和高鹽2種脅迫條件下都大，并且該結(jié)果與不同脅迫條件下總類胡蘿卜素含量結(jié)果一致。

3 討論

Choi等[13]利用OHM培養(yǎng)雨生紅球藻獲得最大藻細胞濃度為2.1×105 個/mL，吳曉娟等[14]研究數(shù)據(jù)顯示，BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)雨生紅球藻可獲得藻細胞濃度為2×105 個/mL，王正方等[15]對雨生紅球藻培養(yǎng)基BG11進行優(yōu)化研究，獲得最大藻細胞濃度為1.7×105 個/mL，試驗的培養(yǎng)條件下4種雨生紅球藻藻株在OHM、BG11、BG11改良培養(yǎng)基取得最佳生物量分別是3.88×106 個/mL（HP3）、3.21×106 個/mL（HP4）、3.67×106 個/mL（HP3在BG11-1中培養(yǎng)取得）。對比上述對應(yīng)培養(yǎng)基的生物量可知，該研究培養(yǎng)條件下獲得的生物量約為上述列舉數(shù)據(jù)的10倍，可能原因是在實驗室適當?shù)耐馀囵B(yǎng)，更加有利于雨生紅球藻綠色營養(yǎng)細胞生長。該研究在雨生紅球藻營養(yǎng)生長過程中，向培養(yǎng)液中通入4%的CO2（CO2/Air，v/v），有效調(diào)整培養(yǎng)基pH的同時，還對培養(yǎng)基補充碳源，試驗還發(fā)現(xiàn)通氣條件能夠在短期內(nèi)將雨生紅球藻紅色孢子轉(zhuǎn)化為綠色營養(yǎng)細胞。4株系雨生紅球藻在7種試驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 d后，在配方A、OHM、BG11-1 3種培養(yǎng)基中生長情況比較好，并在配方A中取得生物量最佳，4株系雨生紅球藻在配方A中的生物量約是OHM和BG11-1中的2倍。

在光合生物中，光照強度的改變可以激發(fā)雨生紅球藻細胞積累蝦青素，保護自身免受光氧化損傷[16-17]，但是不同微藻積累蝦青素最適光照強度和光照脅迫時間存在差異[18-19]，例如，該研究中HP3在光照強度10 000 lx下脅迫9 d后，蝦青素積累最高可達10.17 mg/L，陶云瑩等[20]研究雨生紅球藻在70 000 lx光照強度下脅迫10 d可獲得蝦青素量4.54 mg/L，才金玲等[21]研究雨生紅球藻在14 800 lx光照強度下脅迫15 d可獲得蝦青素量2.88 mg/L。鹽濃度對雨生紅球藻內(nèi)蝦青素形成的影響較復(fù)雜，微藻種類以及生長環(huán)境不同，對于鹽的耐受程度存在差異。高濃度乙酸鈉脅迫時，乙酸根可降低藻細胞防御蛋白酶的活性，使得細胞更加依賴于蝦青素的抗氧化功能[22]，從而促進藻細胞蝦青素積累，但是高鹽脅迫會影響藻細胞的滲透作用[23]，減少藻生物量。氮源濃度過高或者過低都會對微藻產(chǎn)生脅迫作用，但一般而言，微藻（尤其是雨生紅球藻）中缺氮對蝦青素積累量的影響要大于高濃度的氮對蝦青素積累量的影響[24]。雨生紅球藻培養(yǎng)物中氮的缺乏會抑制1，5一二磷酸核酮糖羧化酶的合成，從而影響卡爾文循環(huán)的第1個固碳反應(yīng)，從而對藻細胞進行脅迫[25]。缺氮脅迫雨生紅球藻積累蝦青素時，氮的缺失是有限度的，缺氮到一定程度會嚴重降低藻種的生物量，并降低總的色素產(chǎn)量[16，26-27]。該研究中，光脅迫下蝦青素的積累量明顯低于缺氮，這是由于前者是單因素誘導(dǎo)，后者是雙因素誘導(dǎo)，光和缺氮2個因子是通過不同途徑對藻細胞進行脅迫的，其作用效果是疊加的[24]。光照強度10 000 lx條件下，脅迫下蝦青素積累量較低，可能原因是鹽濃度過高。

參考文獻

[1] FASSETT R G，COOMBES J S.Astaxanthin in cardiovascular health and disease[J].Molecules，2012，17（2）：2030-2048.

[2] HAN D X，LI Y T，HU Q.Astaxanthin in microalgae：Pathways，functions and biotechnological implications[J].Algae，2013，28（2）：131-147.

[3] AMBATI R R，PHANG S M，RAVI S，et al.Astaxanthin：Sources，extraction，stability，biological activities and its commercial applications：A review[J].Marine drugs，2014，12（1）：128-152.

[4] PREZLPEZ P，GONZLEZGARCA S，JEFFRYES C，et al.Life cycle assessment of the production of the red antioxidant carotenoid astaxanthin by microalgae：From lab to pilot scale[J].Journal of cleaner production，2014，64：332-344.

[5] LI J，ZHU D L，NIU J F，et al.An economic assessment of astaxanthin production by large scale cultivation of Haematococcus pluvialis[J].Biotechnology advances，2011，29（6）：568-574.

[6] KOLLER M，MUHR A，BRAUNEGG G.Microalgae as versatile cellular factories for valued products[J].Algal research，2014，6：52-63.

[7] MILLEDGE J J.Commercial application of microalgae other than as biofuels：A brief review[J].Reviews in environmental science &bio/technology，2011，10（1）：31-41.

[8] PANIS G，CARREON J R.Commercial astaxanthin production derived by green alga Haematococcus pluvialis：A microalgae process model and a technoeconomic assessment all through production line[J].Algal research，2016，18：175-190.

[9] BARROS M P，POPPE S C，SOUZAJUNIOR T P.Putative benefits of microalgal astaxanthin on exercise and human health[J].Revista brasileira de farmacognosia，2011，21（2）：283-289.

[10] YIN S C，WANG J F，CHEN L，et al.The water footprint of biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis is greatly decreased by using sealed narrow chambers combined with slow aeration rate[J].Biotechnology letters，2015，37（9）：1819-1827.

[12] SOLOVCHENKO A E，CHIVKUNOVA O B，MASLOVA I P.Pigment composition，optical properties，and resistance to photodamage of the microalga Haematococcus pluvialis，cultivated under high light[J].Russian journal of plant physiology，2011，58（1）：9-17.

[13] CHOI Y E，YUN Y S，PARK J M，et al.Determination of the time transferring cells for astaxanthin production considering twostage process of Haematococcus pluvialis，cultivation[J].Bioresource technology，2011，102（24）：11249-11253.

[14] 吳曉娟，唐小平，蘇艷秋，等.生產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻藻株及其培養(yǎng)基篩選[J].中國飼料，2016（8）：29-32.

[15] 王正方，張慶，呂海燕，等.溫度、鹽度、光照強度和pH對海洋原甲藻增長的效應(yīng)[J].海洋與湖沼，2001，32（1）：15-18.

[16] CORDERO B F，COUSO I，LEN R，et al.Enhancement of carotenoids biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii by nuclear transformation using a phytoene synthase gene isolated from Chlorella zofingiensis[J].Applied microbiology &biotechnology，2011，91（2）：341-351.

[17]DEMMIGADAMS B，ADAMS W W.Antioxidants in photosynthesis and human nutrition[J].Science 2002，298（5601）：2149-2153.

[18] 范勇，于廣欣，汪樂霓，等.雨生紅球藻質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與原核表達[J].水生生物學報，2012，36（4）：640-645.

[19] KIM J H，AFFAN A，JANG J，et al.Morphological，molecular，and biochemical characterization of astaxanthinproducing green microalga Haematococcus sp.KORDI03（Haematococcaceae，Chlorophyta）isolated from Korea[J].J Microbiol Biotechnol，2015，25（2）：238-246.

[20] 陶云瑩，王巧晗，赫勇，等.光照強度和溫度對雨生紅球藻生長、蝦青素及內(nèi)源脫落酸積累的影響[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2016，46（8）：28-36.

[21] 才金玲，歐陽澤瑞，陳國興，等.光照強度對雨生紅球藻細胞生長和蝦青素積累的影響[J].食品科技，2013，38（1）：17-20.

[22] LEMOINE Y，SCHOEFS B.Secondary ketocarotenoid astaxanthin biosynthesis in algae：A multifunctional response to stress[J].Photosynthesis research，2010，106（1/2）：155-177.

[23] WAYAMA M，OTA S，MATSUURA H，et al.Threedimensional ultrastructural study of oil and astaxanthin accumulation during encystment in the green alga，Haematococcus pluvialis[J].PLoS One，2013，8（1）：1-9.

[24] BOROWITZKA M A，HUISMAN J M，OSBORN A.Culture of the astaxanthinproducing green alga Haematococcus pluvialis 1.Effects of nutrients on growth and cell type[J].Journal of applied phycology，1991，3（4）：295-304.

[25] 董慶霖，趙學明，邢向英.乙酸鈉誘導(dǎo)雨生紅球藻合成蝦青素的機理[J].微生物學通報，2007，34（2）：256-260.

[26] MARKOU G，NERANTZIS E.Microalgae for highvalue compounds and biofuels production：A review with focus on cultivation under stress conditions[J].Biotechnology advances，2013，31（8）：1532-1542.

[27] TOUCHETTE B W，BURKHOLDER J M.Review of nitrogen and phosphorus metabolism in seagrasses[J].Journal of experimental marine biology & ecology，2000，250（1）：133-167.