謝體波　張凱　何方洋

摘要[目的]研究動物制品中磺胺類藥物殘留的便捷式檢測技術。[方法]比較ELISA法、毛細管電泳法、高效液相色譜法檢測動物制品中磺胺類藥物的殘留。[結果]利用ELISA法檢測磺胺類藥物殘留具有操作簡便、成本低廉、檢測速率快、檢測時間短等優(yōu)點。[結論]ELISA法能更符合快速檢測的要求，滿足對肉制品中磺胺類藥物快速檢測。

關鍵詞動物制品；磺胺類藥物殘留；便捷式檢測；ELISA

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）08-0161-03

Convenient Detection Technology of Sulfonamides Residues in the Foods of Animal Products

XIE Tibo1，ZHANG Kai1，HE Fangyang2 et al（1.Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009；2.Beijing Qinbang Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 100012）

Abstract[Objective]To study the convenient detection technology of sulfonamides residues in the foods of animal products.[Method]To compare the technology of ELISA，capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for detecting the sulfonamides residues in the foods of animal products.[Result]Using ELISA method to detect sulfonamides residues has advantages of easy operating， low cost， fast rate and short time.[Conclusion]ELISA can better meet the requirements of rapid detection and meet the rapid detection of sulfonamides in meat products.

Key wordsAnimal products；Sulfonamides residues；Convenient detection；ELISA

基金項目磺胺類、阿維菌素類藥物快速檢測技術開發(fā)及產業(yè)化項目；技術中心創(chuàng)新能力建設項目（20170002）；慢抗快速檢測試劑盒產業(yè)化。

作者簡介謝體波（1985—），男，貴州遵義人，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測研究。*通訊作者，從事食品安全生物技術研究。

收稿日期2017-12-11

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一種化學合成的兩性化合物，能抑制干擾大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些陰性菌[1]，在醫(yī)學和多種動物的感染性疾病防治中應用較為廣泛，有數(shù)十種具有很好的療效[2-4]。但其可殘留于動物機體之中，人體攝入后，當其濃度超過峰值時，將對人體泌尿系統(tǒng)造成破壞，導致耐藥菌株產生或菌失調等癥狀，嚴重時還會產生過敏及致癌性作用[5-9]。因此，如何合理又快速地檢測畜禽肉質品種的磺胺類藥物，保證食品安全變得尤為重要。在國際規(guī)定的畜禽類食品中總磺胺以及單個磺胺的最高殘留限量為0.100 mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶的最高殘留限量為0.025 mg/kg[10-11]。

目前檢測磺胺類獸藥殘留的方法有很多，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）、Barham 法等[12-17]，但上述方法由于試驗前處理繁瑣，試驗設備操作復雜，因而不適應大規(guī)模的檢查和現(xiàn)場監(jiān)控，從而影響食品安全檢測速率。

該研究中相關檢測產品與上述儀器相比具有簡便、快速、靈敏度高、準確等特點，能最大限度地減少工作時間和操作誤差，可檢測動物性食品中磺胺類藥物殘留量。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試劑。

乙腈、乙酸乙酯、正己烷、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸氫二鈉、去離子水。

1.1.2主要儀器。微孔板酶標儀 450 nm/630 nm，旋轉蒸發(fā)儀，均質器，振蕩器，渦旋儀，離心機，天平（感量0.01 g），刻度移液管，洗耳球，500 mL 容量瓶，10 mL 玻璃試管，2、50 mL 聚苯乙烯離心管，微量移液器。

1.1.3試劑盒提供材料與試劑。

96孔酶標板1塊（包被有偶聯(lián)抗原），0、1、3、9、27、81 μg/L標準品6瓶（1 mL/瓶），1 μg/mL高濃度標準液1瓶（1 mL/瓶），7 mL 抗體工作液，7 mL 底物液A液，7 mL底物液B液，12 mL酶標二抗，2倍濃縮復溶液 20 mL，20倍濃縮洗滌液40 mL，終止液7 mL。

1.1.4

配制溶液。

配液1：乙腈-乙酸乙酯溶液，量取25 mL 乙腈和25 mL 乙酸乙酯加至50 mL 容量瓶中，混勻；配液2：0.18 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，

稱取23.22 g 十二水合磷酸氫二鈉和3.91 g 二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL 去離子水溶解混勻；

配液3：0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，稱取25.80 g 十二水合磷酸氫二鈉和4.35 g 二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL 去離子水溶解混勻；

配液4：復溶工作液，

用去離子水將濃縮復溶液按1∶1體積稀釋，用于樣本復溶；配液5： 洗滌液，用去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋（1 mL 20倍濃縮洗滌液+19 mL去離子水），用于酶標板的洗滌。

1.2檢測方法

1.2.1原理。該研究采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，讓原有樣本中所殘留的磺胺類藥物與酶標板微孔條上預包裝偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物使其顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量呈負相關，與標準曲線相比，再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，就可以得出磺胺類藥物的殘留量。

1.2.2組織樣本前處理。

①稱取1 g均質后的雞肉或豬肉組織樣本到50 mL 聚苯乙烯離心管中，加入0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動樣本成糊狀，加入7 mL 乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩均勻。當樣本組織溶液超過3 kg時，應保持20～25 ℃離心5 min。②移取2 mL 上層有機液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50～60 ℃ 水浴氮氣流下吹干。

③加入0.5 mL 正己烷，用渦旋儀渦動30 s溶解干燥的殘留物，再加入0.5 mL 復溶工作液，用渦旋儀渦動30 s，混勻，轉入2 mL 聚苯乙烯離心管中。④除去上層有機相，取下層水相25 μL 用于分析。

1.2.3操作步驟。

①將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，使其回溫至室溫（20～25 ℃），每種試劑在使用之前都要搖勻。

②取出微孔板，將豬肉或雞肉樣本和標準品按對應微孔序列排序，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

③加標準品和樣本25 μL到編號所相對的微孔中，然后加入25 μL/孔抗體工作液，輕輕搖晃混合，蓋上膜蓋板后置25 ℃，在避光環(huán)境中反應30 min。

④將孔內的液體甩干，加入洗滌工作液200 μL/孔，反復洗滌3～4次，每次間隔8 s，用吸水紙拍干。

⑤加入酶標二抗50 μL/孔，輕輕振蕩混合，在25 ℃避光環(huán)境中反應30 min，然后重復步驟④。

⑥加入底物液A液25 μL/孔，再加入底物液B液25 μL/孔，輕輕振蕩混合，蓋膜蓋板后置25 ℃避光環(huán)境反應15 min，最終使其有顯色反應。⑦加入終止液25 μL/孔，輕輕混勻，設定酶標儀于630 nm處，測定每孔OD值。

1.2.4試劑盒其余指標檢測方法。

依次對試劑盒的標準性、特異性、靈敏度、精密度進行研究，并將其中的靈敏度、準確度和精密度與高效液相色譜檢測的相關數(shù)據(jù)標準性進行對比。

1.2.5磺胺類藥物殘留定量分析。

樣本或標準品吸光率百分比等于樣本或標準品吸光度值的平均值除以第1個標準品吸光度值的平均值，再乘以100%，即

百分吸光率=B/B0×100%

式中，B為標準品或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0 μg/L標準溶液的平均吸光度值。

由于標準品吸光率的變化，以標準品的吸光度值為縱坐標，磺胺類藥物標準品對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖，帶入百分比吸光率，從標準曲線上得出樣本對應的濃度值，再乘以樣本稀釋的倍數(shù)，即為磺胺類藥物的真實濃度。其中組織樣本稀釋1倍，畜禽肉樣本稀釋倍數(shù)為4倍。

1.2.6試劑準確度和精密度的測定。準確度是指測定值與實際值間的符合程度，通常用回收率表示。精密度是反映檢測方法對某一固定樣品多次測定所得的重復程度，又稱為重復性，這也是評定化學發(fā)光試劑盒質量的基本參數(shù)。在此次測定范圍中，就通過測定樣品中的相應參數(shù)來判斷該試劑盒與其他檢測手段的區(qū)別。

1.2.7研究其他藥物的交叉反應率。

交叉反應率是指不同結構的抗原定性簇與抗體結合的能力。選擇磺胺甲基異噁唑作為相應標準，按上述操作步驟，加入不同類的磺胺類競爭物，以試驗所得化學發(fā)光強度值，計算抑制百分比，制作相應的百分曲線，通過抑制濃度，計算競爭物的交叉反應率。

1.3注意事項

①當室溫低于20 ℃或試劑及樣本未回到室溫，可能導致所有標準品的吸光度值偏低。

②此次使用的終止液為2 mol/L硫酸，操作時禁止與皮膚接觸。

③在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會導致標準曲線不呈線性、重復性不好，所以將洗板抖干后應立即進行下一步操作。

④當加入底物液A液和B液時，顯色時間通常為12～15 min。⑤每加1種試劑前需要將其搖勻。⑥該試劑應儲存在2～8 ℃ 環(huán)境中，禁止冷凍并避免直接暴露在光線下。⑦發(fā)色試劑有任何顏色變化表示其已變質，應當棄之。

2結果與分析

2.1反應時間優(yōu)化

使用上述方法加入與之對應的標準品和抗體，室溫下反應4、8、12、16 min后加入發(fā)光溶液，最終結果表明反應時間為12 min時，發(fā)光值最大（圖1）。

2.2標準曲線

以磺胺甲基異噁唑標準品濃度對數(shù)為橫坐標，百分發(fā)光率為縱坐標，繪制抑制標準曲線（圖2）。

從圖2得到曲線線性方程y=-16.748x+85.442，R2=0.985 6，其中y為百分發(fā)光率，x為標準品濃度（C）對數(shù)。運用專業(yè)分析軟件替換相應橫坐標，所得標準工作曲線見圖3，根據(jù)圖3相應數(shù)據(jù)得出試劑盒在1.0～81.0 ng/mL線性范圍內關系良好。

對空白豬肉做20次試驗，采用試驗結果平均值加上3倍標準差的方法檢測出最低檢出限，根據(jù)公式計算出該試劑盒豬肉最低檢出限為0.93 μg/kg。

2.3試劑特異性的確定

選擇5種磺胺類藥物（磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑），計算出交叉反應率，結果表明交叉反應率都較高，所以該試劑盒適用于檢測以上5種藥物，并能更好地表示所檢測數(shù)據(jù)的特異性。

2.4準確度與精密度的測定

ELISA法、毛細管電泳法、高效液相色譜法[20]通常以回收率表示準確度，以變異系數(shù)表示精密度。從表2～4可以看出，取空白豬肉樣本，分別添加磺胺甲基異噁唑標準品

磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑至1、2 μg/kg，比較各個方法之間的差別。

3結論

我國對磺胺類藥物在動物制品中的殘留限量有著明確規(guī)定，然而在檢測中大部分操作方法都面臨耗時長、成本高等問題。該研究對快速檢測磺胺類藥物殘留的3種方法進行對比，驗證ELISA法、毛細管電泳法、高效液相色譜法對檢測磺胺類藥物準確度與靈敏度之間的差異。在研究中發(fā)現(xiàn)ELISA法對磺胺類藥物抑制標準曲線線性良好，在試驗過程中5種磺胺類藥物交叉反應率高，且試劑標準曲線范圍廣，最低檢測限為0.93 μg/kg，ELISA試劑盒法添加回收率為90.7%～101.0%，變異系數(shù)為0.4%～5.9%；毛細管電泳法添加回收率為84.2%～102.0%，變異系數(shù)為0.8%～7.2%；高效液相色譜法添加回收率為83.0%～97.3%，變異系數(shù)為3.4%～10.8%。由此可以看出，ELISA試劑盒法的準確度與精密度均高于毛細管電泳法和高效液相色譜法。該方法不僅滿足國家規(guī)定的各項檢測指標，而且與毛細管電泳法、高效液相色譜法相比時間縮短，符合分析周期短，樣品前處理簡單、迅速、靈敏的檢測要求?？梢娪肊LISA法以及提供的試劑更符合快速檢測的要求，能滿足對肉制品中磺胺類藥物快速檢測。

參考文獻

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陳炳卿，孫長顥.食品污染與健康[M].北京：化學工業(yè)出版社，2002.

[2] 關舒函.黑龍江省豬肉中五種磺胺類藥物殘留的檢測與風險評估[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2016.

[3] 姜大富.磺胺類藥物的臨床應用及使用心得[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（6）： 85.