黃敏　馮廣鑫　朱素芹　吳浩浩

摘要 [目的]探究堿法絮凝采收聚球藻7002的效果和機(jī)制。[方法]通過研究不同pH、沉降時間和藻細(xì)胞濃度對絮凝效果的影響，確定堿法絮凝聚球藻7002的最佳條件，通過檢測藻體Zeta電位和藻體沉淀中Ca2+和Mg2+的濃度，分析堿法絮凝收集聚球藻7002的機(jī)制，并根據(jù)采收的藻細(xì)胞的生長情況，評估堿絮凝方法的安全性。[結(jié)果]堿法絮凝采收聚球藻7002的最佳pH和沉降時間分別為10.5和120 min，采收過程不受藻細(xì)胞濃度的影響。當(dāng)絮凝pH 為10.5時，藻體Zeta電位（絕對值）最低，Mg（OH）2沉淀大量形成，并通過正負(fù)電荷中和作用誘導(dǎo)藻細(xì)胞絮凝。此外，pH 10.5的絮凝條件不會對藻細(xì)胞的生理活性產(chǎn)生明顯影響。[結(jié)論]該試驗(yàn)得到了一種經(jīng)濟(jì)高效采收聚球藻7002的方法。

關(guān)鍵詞 微藻；聚球藻7002；采收；堿法絮凝；絮凝效率

中圖分類號 S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）18-0009-04

Alkaline Flocculation for Harvesting Synechococcus sp. PCC 7002

HUANG Min， FENG Guangxin， ZHU Suqin et al

（College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao， Shandong 266003）

Abstract [Objective] To study the effect and mechanism of alkaline flocculent of Synechococcus sp. PCC 7002. [Method] The effects of pH， settling time and biomass concentration on flocculent efficiency were studied to obtain the optimal flocculent condition. Zeta potential of algal and Ca2+ and Mg2+ concentrations in the sediment were determined to analyze the mechanism of alkaline flocculation of Synechococcus sp. PCC 7002. The growth of harvested cells were also examined to evaluate the safety of alkaline flocculation. [Result] The optimal pH and settling time were 10.5 and 120 min， respectively， and the alkaline flocculation was not affected by biomass concentration. When pH was 10.5， the Zeta potential of the algae was the lowest and the charge neutralization between Mg（OH）2 precipitate and algal cells was found to be the main mechanism of alkaline flocculation of Synechococcus sp. PCC 7002. Additionally， the flocculation at pH 10.5 had no significant effect on the physiological activity of the harvested Synechococcus sp. PCC 7002. [Conclusion] The present study provided a costeffective method to harvest Synechococcus sp. PCC 7002.

Key words Microalgae；Synechococcus sp. PCC 7002；Harvesting；Alkaline flocculation；Flocculent efficiency

微藻是一種光合自養(yǎng)微生物，具有易于人工培養(yǎng)、光合作用效率高、生長周期短、單位時間內(nèi)生物量高等優(yōu)點(diǎn)。微藻富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、色素等多種活性物質(zhì)，可用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品[1]。另外，其在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用，如生物修復(fù)廢水、減排CO2等[2-4]。因此，有望用于緩解由人口增加、耕地面積減少、環(huán)境污染等因素造成的原料不足的問題[5]。微藻培養(yǎng)及采收成本高是制約其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵[6-7]。另外，微藻細(xì)胞體積小、培養(yǎng)密度低、細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，可均勻、穩(wěn)定地分散于培養(yǎng)液中，給集中采收帶來許多困難[8]。建立高效的采收技術(shù)對降低微藻生產(chǎn)成本有重要意義。

目前采收方法主要有過濾法、氣浮法、離心法及絮凝法等[9]。這些方法中，絮凝法一直以設(shè)備投資少、分離過程簡單、易于快速處理大量藻液而被廣泛應(yīng)用[10]。其原理是通過電中和減少藻細(xì)胞間的靜電斥力，使單個藻細(xì)胞形成較大的聚集物，再通過重力沉淀與培養(yǎng)介質(zhì)分離而采收。通過投加堿液，調(diào)節(jié)藻液的pH，使藻細(xì)胞發(fā)生自絮凝稱為堿法絮凝，該方法具有低成本、能耗小和無化學(xué)污染等優(yōu)點(diǎn)[11]。因此，堿法絮凝是一種較理想的采收方法。

筆者以聚球藻 7002（Synechococcus sp.PCC 7002）為研究對象，探索了堿法絮凝收集該微藻的效果，并探討了相關(guān)機(jī)理，為堿法絮凝的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1

材料。聚球藻 7002由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙進(jìn)東院士惠贈。培養(yǎng)基采用Medium A（pH 8.2），培養(yǎng)于100 mL三角瓶中，搖瓶培養(yǎng)15 d，條件為150 r/min、30 ℃、光強(qiáng)8 000 lx，OD750反映聚球藻7002的生物量[12]。氫氧化鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2

儀器。TS-211GZ 光照恒溫?fù)u床（上海儀純實(shí)業(yè)有限公司）；S210-K pH計(jì)（METTLER TOLEDO）；TGL-20B 高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Power Wave XS2酶標(biāo)儀（Gene Company Limited）；Zetasizer Nano ZS 90 納米粒度電位儀（Malvern Instruments）；DigiBlock ED36電熱消解儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；AA-6880F/AAC原子吸收分光光度計(jì)（Shimadzu Corporation）。

1.2 絮凝試驗(yàn)

取10 mL聚球藻7002藻懸液置于15 mL離心管中，用5 mol/L氫氧化鈉溶液將藻懸液pH分別調(diào)至95、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，室溫靜置120 min后取離液面深1 cm處的液體，在750 nm處測定其吸光值。絮凝效率通過式（1）計(jì)算。取10 mL聚球藻7002藻懸液置于15 mL離心管中，在8 000 r/min條件下離心 10 min后，取離液面深1 cm處的液體，在750 nm處測定其吸光值作為對照。

絮凝效率=（1-A/B ）×100%（1）

式中，A為藻液絮凝結(jié)束后OD750；B為藻液初始OD750。

1.3 pH 10.5絮凝聚球藻7002條件的確定

1.3.1

沉降時間。研究pH 10.5條件下，沉降時間對聚球藻7002絮凝效果的影響。用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)藻液pH為10.5，連續(xù)300 min跟蹤測定上清體積變化，以上清體積占藻液總體積的百分比為指標(biāo)確定聚球藻7002在pH 10.5條件下完全絮凝的時間。

1.3.2

藻細(xì)胞濃度。研究pH 10.5條件下，藻細(xì)胞濃度對聚球藻7002絮凝效果的影響。用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)藻液pH為10.5，藻液中濕藻含量分別為4、8、12和16 g/L，靜置120 min后記錄絮凝效率。

1.4 Zeta 電位測定

取1 mL不同pH絮凝后藻液置于U 型比色皿中，放入納米粒度電位儀中進(jìn)行檢測。

1.5 Ca2+和Mg2+濃度測定

離心（8 000 r/min、10 min）后上清液以及pH 10.5、11.0和11.5絮凝后的上清液經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾備用，藻體沉淀分別重懸于等體積的超純水中，并在550 r/min條件下振動60 min，使藻體分散均勻。量取5 mL重懸后的藻液于玻璃消解管中，加入15 mL消化液（高氯酸∶硝酸=1∶4），利用電熱消解儀（DigiBlock ED36，北京萊伯泰科儀器股份有限公司）進(jìn)行消化。取Ca 和Mg 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL），用1 mol/L HNO3稀釋成1、2、3、4、5 mg/L的Ca標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的Mg標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。用原子吸收分光光度計(jì)（AA-6880F/AAC，Shimadzu Corporation）測量標(biāo)準(zhǔn)系列吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并在相同條件下測定和計(jì)算上清液、藻體消化液中Ca2+和Mg2+的含量。

1.6 堿法絮凝收集聚球藻7002的安全性評估試驗(yàn)

將pH 10.5、11.0和11.5絮凝120 min的聚球藻7002重新接種到新鮮的培養(yǎng)液中，離心（8 000 r/min、10 min）獲得的聚球藻7002作為對照，連續(xù)14 d測定聚球藻7002在750 nm處的吸光值。采用修正Gompertz方程，對聚球藻7002的生長動態(tài)進(jìn)行擬合，即一級模型。Gompertz方程如下：

lgN（t）=lgN0+lgNmaxN0×expμmax×2.718lg（Nmax/N0）×（Lag-t）+1（2）

式中，N（t）為培養(yǎng)時間為t時的聚球藻的密度（OD750）；N0和Nmax分別為初始和最大聚球藻7002的密度（OD750）；μmax為最大比生長速率（d-1）；Lag為延滯時間（d）；t為培養(yǎng)時間（d）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）來表示。采用最小顯著差異法（the least significant difference，LSD），在SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中比較、分析均值的差異性，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿法絮凝收集聚球藻7002條件的確定

聚球藻7002在不同高pH條件下靜置120 min的絮凝效率如圖1A所示。培養(yǎng)基pH為10.0時，聚球藻7002的絮凝效率較低，為13.8%；當(dāng)pH升高至10.5時，絮凝效率得到顯著提高（P<0.05），達(dá)87.8%；當(dāng)培養(yǎng)基pH為11.0時，絮凝效率達(dá)96.7%，繼續(xù)提高培養(yǎng)基的pH，絮凝效率無顯著性變化。研究表明，離心方法可以有效采收微藻[13]，pH 10.5絮凝后的上清在750 nm處的吸光值與8 000 r/min條件下離心 10 min后上清的吸光值相同，說明pH 10.5可以有效地絮凝聚球藻7002。當(dāng)pH≥11.0時，絮凝效率提高可能是由于培養(yǎng)基中雜質(zhì)也被絮凝沉淀。由圖1B可知，pH 10.5時絮凝速度最快；當(dāng)pH≥11.0時，絮凝120 min后，藻體依然沒有完全沉淀；pH 12.0絮凝后藻體顏色變黃，說明藻細(xì)胞生理活性明顯受到損傷。

Blanchemain等[14]分析，在高pH環(huán)境下，絮凝時間會影響藻細(xì)胞的生命活力。為了確定pH 10.5絮凝聚球藻7002的最佳沉降時間，連續(xù)300 min跟蹤測定上清體積的變化。由圖2可知，隨著絮凝時間增加，上清體積逐漸增加，當(dāng)絮凝至120 min時，上清體積占總體積的60.3%，繼續(xù)延長絮凝時間，上清體積增加不顯著。

在搖瓶培養(yǎng)條件下，穩(wěn)定期的聚球藻7002濕重達(dá)4 g/L。實(shí)際上，絮凝過程中會遇到不同濃度的藻液，為了評價藻細(xì)胞濃度對pH 10.5誘導(dǎo)聚球藻7002絮凝效果的影響，研究了pH 10.5對濕藻含量為4、8、12、16 g/L藻液的絮凝效果。由圖3可知，藻細(xì)胞濃度對堿法絮凝聚球藻7002的效果無顯著影響。

2.2 Ca2+和Mg2+在堿法絮凝中的變化

由圖4可知，堿法絮凝之前，99%的Ca2+和Mg2+存在于上清中。pH 10.5絮凝后，上清中Ca2+以及藻體沉淀中Ca2+濃度幾乎沒有改變；而上清中Mg2+大量減少，藻體沉淀中Mg2+增加了26%，且此時藻細(xì)胞幾乎完全被絮凝（圖1）。當(dāng)絮凝pH≥11.0時，隨著pH增大，上清中Ca2+和Mg2+濃度逐漸降低，藻體沉淀中Ca2+和Mg2+濃度逐漸升高。

2.3 pH對藻體Zeta電位的影響

從圖5可以看出，堿法絮凝之前，藻體Zeta電位為-15.33mV，說明聚球藻7002細(xì)胞

表面帶負(fù)電荷；當(dāng)培養(yǎng)基pH <10.5時，隨著培養(yǎng)基pH增加，藻體Zeta電位（絕對值）變化不顯著；當(dāng)培養(yǎng)基pH為10.5時，藻體Zeta電位（絕對值）迅速降低，達(dá)到最低值，說明藻細(xì)胞表面的負(fù)電荷被中和；當(dāng)培養(yǎng)基pH >10.5時，隨著培養(yǎng)基pH繼續(xù)增加，藻體Zeta電位（絕對值）有上升的趨勢。

2.4 堿法絮凝收集聚球藻7002的安全性評估

堿法絮凝和離心獲得的聚球藻7002藻細(xì)胞的生長情況如圖6所示，誘導(dǎo)藻細(xì)胞絮凝的pH越低，絮凝后藻細(xì)胞的生長狀態(tài)越接近離心獲得的藻細(xì)胞。用修正Gompertz方程擬合藻細(xì)胞生長曲線，求出藻細(xì)胞的動力學(xué)參數(shù)，對照組和pH 10.5、11.0和11.5曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 8、0.997 9、0.997 3和0.981 8，證明曲線擬合有效（表1）。在pH 10.5條件下，聚球藻7002生長，其延滯期、最大生長速率和最大藻體密度與對照相比均無顯著差異（P>0.05）；在pH 11.0條件下，聚球藻7002的延滯期與對照無顯著差異，但是最大生長速率和最大藻體密度顯著低于對照組（P<0.05）；在pH 11.5條件下，第2天的藻體密度反而比初始數(shù)值低，之后開始增長加快，其延滯期為3.085 2 d，是對照組的2.37倍，最大藻體密度顯著低于對照組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

該研究中，pH 10.5可迅速實(shí)現(xiàn)微藻的絮凝。Pérez 等[15]認(rèn)為，當(dāng)培養(yǎng)基pH為11.0、11.5和12.0時，中肋骨條藻和纖細(xì)角毛藻的絮凝效率為90%以上；Yang等[16]認(rèn)為，利用氫氧化鈉增加培養(yǎng)基pH，小球藻的絮凝效率達(dá)90%。這說明堿法可有效實(shí)現(xiàn)微藻的絮凝，降低采收成本。在高pH條件誘導(dǎo)下，Ca2+和Mg2+等離子起重要作用[17]。pH 10.5絮凝聚球藻7002后，上清中Ca2+以及藻體沉淀中Ca2+濃度幾乎沒有發(fā)生改變，而上清中Mg2+濃度減少，藻體沉淀中Mg2+濃度增加。另外，Vandamme等[18]發(fā)現(xiàn)，在高pH誘導(dǎo)小球藻絮凝試驗(yàn)中，Mg2+（≥ 0.15 mmol/L）是必不可少的；Wu等[19]研究了高pH誘導(dǎo)綠球藻等淡水微藻以及三角褐指藻等海洋微藻的絮凝效果，結(jié)果表明，微藻絮凝后培養(yǎng)基中Mg2+濃度顯著下降。以上研究說明Mg2+在堿法絮凝收集微藻過程中起著重要作用。

當(dāng)pH為10.5時，藻體Zeta電位（絕對值）迅速降到最低值，根據(jù)此時Mg2+濃度變化情況分析其原因，應(yīng)該是此時培養(yǎng)基中的Mg2+形成了表面帶正電荷、吸附面積較大的Mg（OH）2沉淀，并吸附了表面帶負(fù)電荷的藻細(xì)胞，使藻細(xì)胞間的靜電斥力減小，藻體Zeta電位（絕對值）降低，從而致使藻液均勻、穩(wěn)定的狀態(tài)被打破，單個細(xì)胞發(fā)生聚集，在重力的作用下沉降達(dá)到絮凝效果[20]。另外，Mg（OH）2具有相當(dāng)開放的結(jié)構(gòu)，即使在低濃度的情況下，也可以有效誘導(dǎo)藻細(xì)胞的絮凝[19]，這也解釋了pH 10.5絮凝聚球藻7002不受藻細(xì)胞濃度影響的結(jié)果。當(dāng)絮凝pH >10.5時，藻體Zeta電位（絕對值）有上升的趨勢，這表明微藻細(xì)胞表面的羧酸基團(tuán)被解離，從而使絮凝體間的靜電斥力增大，絮凝沉降的速度較pH 10.5時顯著降低。

根據(jù)采收的藻細(xì)胞生長情況和生長動力學(xué)參數(shù)可以看出，采用pH≥11.0的條件對聚球藻7002進(jìn)行絮凝時，藻細(xì)胞的生理活性受到損傷，致使藻細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的能力下降，嚴(yán)重影響了其后續(xù)的生長增殖，pH 10.5時，對微藻細(xì)胞后續(xù)生長繁殖無顯著影響。

該試驗(yàn)通過分析堿絮凝法，獲得聚球藻7002的最佳絮凝條件為pH 10.5，最佳沉降時間為120 min，絮凝過程不受微藻濃度的影響。該結(jié)果可為聚球藻7002的規(guī)?；囵B(yǎng)和采集提供理論依據(jù)。

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